Ensaios de Retardamento de Gel de Agarose Protein-tRNA para Análise do<em> N</em⁶ -Treonilcarbamoyladenosina TcdA Function

O teste de retardamento de gel ¹ (também conhecido como ensaio de mudança de mobilidade eletroforética, EMSA) é um método eletroforético projetado para estudar e caracterizar interações proteína-ácido nucleico. Ele permite a análise do DNA da proteína e das interações proteína-ARN e, em particular, as interações entre as proteínas de ligação de ARNt e ARNt, utilizando componentes purificados ou misturas complexas de proteínas ( por exemplo , lisados ​​celulares) ou ácidos nucleicos ( por exemplo , tRNA Piscinas). Nós aplicamos ensaios de retardamento de gel ao estudo da interação entre ARNt purificado (UUU) e TcdA, uma N6-teronilcarbamoiladenosina (t ⁶ A) desidratase, que cicliza a cadeia lateral de treonilcarbamoílo anexada a A37 no anel de tronco anticodon (ASL) De tRNAs para t ⁶ cíclico (ct ⁶ A) ^{2 , 3} . TcdA também é conhecido como CsdL ^{3 ,}F "> 4. O gene tcdA / csdL forma um cluster com os genes csdA e csdE ⁵ , que codificam a dessulfurase de cisteína e o aceitador de enxofre do sistema de desulfinato de cisteína sulfinase (CSD) e é necessário para manter a função TcdA in vivo ³ .

O raciocínio por trás dos ensaios de retardamento de gel é que, enquanto as moléculas de ácido nucleico livres migram rapidamente para a frente da acrilamida ou géis de agarose em virtude da sua grande carga negativa, a mobilidade eletroforética de complexos de proteína dos mesmos ácidos nucleicos é dramaticamente reduzida. A redução da mobilidade é visualizada como uma "mudança" nos complexos de ácido nucleico-proteína, que se resolvem como bandas discretas. O complexo de ácido nucleico e proteína positivamente carregado e maior apresenta uma maior mudança ou redução na mobilidade em um gel.

Uma vez que a neutralização da carga do complexo é um fenômeno universalPara os complexos proteína-ácido nucleico, o teste de retardamento do gel pode ser aplicado a uma ampla gama de complexos e tipos de ácidos nucleicos. O método é simples, barato e pode ser realizado em laboratórios com equipamentos mínimos. Requer apenas pequenas quantidades de proteínas e ARNt. Esta é uma vantagem em relação às técnicas biofísicas alternativas, que geralmente consomem maiores quantidades de amostra.

O teste de retardamento de gel tem sido amplamente utilizado para o estudo de fatores de transcrição. O ensaio tem sido utilizado para analisar a cinética de ligação, a força e a especificidade dos fatores de transcrição para muitas seqüências de DNA diferentes. Foi nesse campo que a EMSA foi desenvolvida pela primeira vez ^{6 , 7} . Os ensaios de retardamento de gel com moléculas de ARN ^{8 , 9 , 10 , 11} e tRNA também foram utilizados na pesquisa de ribossomosE analisar, como fazemos aqui, as enzimas que modificam os nucleósidos de tRNA pós-transcrição.

Muitos parâmetros diferentes afetam o resultado de um teste de retardamento de gel, como temperatura, qualidade da proteína e amostra de tRNA, e a força da ligação. O planejamento cuidadoso ea execução do experimento são cruciais para a interpretação dos resultados do ácido nucleico livre e das espécies ligadas a proteínas. Aqui, usamos o gene sintético que codifica tRNA (UUU) clonado em um vetor de expressão cujo promotor não possui o local de ligação do ribossoma Shine-Dalgarno, levando à síntese de grandes quantidades do tRNA ² . Este protocolo detalhado destina-se a fornecer um guia claro para realizar experiências de retardamento de gel de ARNt, evitando erros comuns.