Dosages de retard de gel d'agarose et de protéine-ARNt pour l'analyse de la<em> N</em⁶ -thereylcarbamoyladénosine TcdA Fonction

Le test de retard de gel ¹ (également connu sous le nom de test de déplacement de mobilité électrophorétique, EMSA) est une méthode électrophorétique conçue pour étudier et caractériser les interactions protéines-acides nucléiques. Il permet l'analyse de l'ADN protéique ainsi que des interactions protéine-ARN et, en particulier, des interactions entre les protéines de liaison à l'ARNt et à l'ARNt, en utilisant soit des composants purifiés, soit des mélanges complexes de protéines ( par exemple , des lysats cellulaires) ou des acides nucléiques ( p . Ex . ARNt Piscines). Nous avons appliqué des essais de retard de gel à l'étude de l'interaction entre l'ARNt purifié (UUU) et TcdA, une N ⁶ -théonylcarbamoyladenosine (t ⁶ A) déshydratase, qui cyclise la chaîne latérale de thréonylcarbamoyle attachée à A37 dans la boucle de tige anticodon (ASL) Des tRNAs à t ⁶ cyclique (ct ⁶ A) ^{2 , 3} . TcdA est également connu sous le nom CsdL ^{3 ,}F "> 4. Le gène tcdA / csdL forme une grappe avec les gènes csdA et csdE ⁵ , qui codent pour la cysteine ​​desulfurase et l'accepteur de soufre du système de désulfinase de cysteine ​​sulfinase (CSD) et est nécessaire pour maintenir la fonction TcdA in vivo ³ .

La raison d'être des tests de retard de gel est que, bien que les molécules d'acide nucléique libres migrent rapidement vers l'avant de l'acrylamide ou des gels d'agarose en raison de leur grande charge négative, la mobilité électrophorétique des complexes de protéines des mêmes acides nucléiques est considérablement réduite. La réduction de la mobilité est visualisée comme un «décalage» dans les complexes acide nucléique-protéine, qui se résolvent sous forme de bandes discrètes. Un complexe de protéines d'acide nucléique et de charge positif et plus large montre un déplacement plus important ou une réduction de la mobilité sur un gel.

Puisque la neutralisation des charges du complexe est un phénomène universelPour les complexes protéine-acide nucléique, l'essai de retard de gel peut être appliqué à une large gamme de complexes et de types d'acides nucléiques. La méthode est simple, peu coûteuse et peut être effectuée dans des laboratoires avec un équipement minimum. Il ne nécessite que de petites quantités de protéines et d'ARNt. C'est un avantage par rapport à d'autres techniques biophysiques, qui habituellement consomment de plus grandes quantités d'échantillons.

Le test de retard de gel a été largement utilisé pour l'étude des facteurs de transcription. Le test a été utilisé pour analyser la cinétique de liaison, la force et la spécificité des facteurs de transcription pour de nombreuses séquences d'ADN différentes. C'est en effet dans ce domaine que l'EMSA a été développée pour la première fois ^{6 , 7} . Des essais de retard de gel avec des molécules d'ARN ^{8 , 9 , 10 , 11} et tRNA ont également été utilisés dans la recherche sur les ribosomesEt d'analyser, comme nous le faisons ici, les enzymes qui modifient les nucléosides d'ARNt post-transcriptionnellement.

De nombreux paramètres différents affectent le résultat d'un essai de retard de gel tel que la température, la qualité de l'échantillon de protéines et d'ARNt et la force de la liaison. Une planification minutieuse et l'exécution de l'expérience est cruciale pour l'interprétation des résultats de l'acide nucléique et des espèces liées aux protéines. Ici, nous avons utilisé le gène synthétique codant pour l'ARNt (UUU) clone dans un vecteur d'expression dont le promoteur n'a pas le site de liaison au ribosome Shine-Dalgarno, ce qui conduit à la synthèse de grandes quantités d'ARNt ² . Ce protocole détaillé est destiné à fournir un guide clair pour effectuer des expériences de retard de gel d'ARNt tout en évitant les erreurs courantes.