Summary

Analiz için Protein-tRNA Agaroz Jel Retardasyon Testleri<em> K</em<sup> 6</sup> Threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Published: June 21, 2017
doi:

Summary

TRNA (UUU) üretimi ve agaroz jel geciktirme testleri ile TcdA enzimi ile kompleks içinde tRNA (UUU) analizi için bir protokol sunulmuştur.

Abstract

Escherichia coli'de tRNA'nın (UUU) eksprese edilmesi ve saflaştırılması için yöntemler ve tRNA'nın (UUU) TcdA, bir N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) dehidrataz ile bağlanmasının jel geciktirme deneyleri ile analizi, bu, threonylcarbamoyl TRNA'ların antikodon kök döngüsünde (ASL) A37'ye bağlanmış yan zincirin siklik t6A'ya (ct 6 A) dönüştürülmesi. TRNA (UUU) kodlayan sentetik genin transkripsiyonu E. coli'de 1 mM izopropil β-D-l-tiogalaktopiranozit (IPTG) ile indüklenir ve tRNA içeren hücreler indüksiyonun 24 saat sonra hasat edilir. RNA fraksiyonu asit fenol ekstraksiyon yöntemi kullanılarak saflaştırılır. Saf tRNA, küçük boyutlu tRNA moleküllerini bozulmamış veya parçalanmış nükleik asitlerden verimli bir şekilde ayıran bir jel filtrasyon kromatografisiyle elde edilir. TRNA'ya (UUU) TcdA bağlanmasını analiz etmek için, TcdA tRNA'ya (UUU) karıştırılır ve doğal bir agaroz jelinde 4 ° C'de ayrılır.Serbest tRNA (UUU) daha hızlı göç ederken, TcdA-tRNA (UUU) kompleksleri jel boyama sırasında gözlemlenebilen bir mobilite geriliğine uğrarlar. TcdA'nın bir tRNA (UUU) bağlayıcı enzim olduğunu kanıtlıyoruz. Bu jel gerilik testi, TcdA mutantlarını ve katkı maddelerinin ve diğer proteinlerin bağlanma üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir.

Introduction

Jel gerilik testi 1 (elektroforetik mobilite kaydırma deneyi EMSA olarak da bilinir), protein-nükleik asit etkileşimlerini incelemek ve karakterize etmek için tasarlanmış bir elektroforetik yöntemdir. Protein-DNA'nın yanı sıra protein-RNA etkileşimlerinin ve özellikle de tRNA ve tRNA-bağlayıcı proteinler arasındaki etkileşimlerin saflaştırılmış bileşenleri veya kompleks protein karışımları ( örn. , Hücre lizatları) veya nükleik asitler ( örn. , TRNA havuzları). Antikoodon kök döngüsünde (ASL) A37'ye bağlanan threonylcarbamoyl yan zincirini siklize eden saflaştırılmış tRNA (UUU) ile TcdA, bir N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) dehidrataz arasındaki etkileşimin incelenmesine jel geciktirme testleri uyguladık TRNA'ların siklik t6'ya (ct 6 A) 2 , 3'e dönüştürülmesi . TcdA ayrıca CsdL 3 olarak bilinir ,Fc > 4. tcdA / csdL geni sistein desulfurase'ı ve sistein sulfinase desulfinate (CSD) sisteminin sülfür akseptörünü kodlayan csdA ve csdE genleri 5 ile bir küme oluşturur ve canlı ortamda TcdA fonksiyonunu sürdürmek için gereklidir 3 .

Jel retardasyon deneylerinin ardındaki mantık, serbest nükleik asit molekülleri, büyük negatif yüklerinden ötürü akrilamidin veya agaroz jellerinin önüne hızla göç ederken, aynı nükleik asitlerin protein komplekslerinin elektroforetik hareketliliği dramatik bir şekilde azalır. Hareketlilikteki azalma, ayrı bantlar olarak çözümlenen nükleik asit-protein komplekslerinde "kayma" olarak görülebilir. Pozitif yüklü ve daha büyük nükleik asit-protein kompleksi, bir jel üzerinde hareketlilikte daha büyük bir kayma veya azalma gösterir.

Kompleksin yükle nötrleştirilmesi evrensel bir fenomendirProtein-nükleik asit kompleksleri için, jel retardasyon tahlili geniş bir kompleks yelpazesine ve nükleik asit tiplerine uygulanabilir. Yöntem basit, ucuzdur ve minimum ekipmanlarla laboratuvarlarda yürütülebilir. Sadece az miktarda protein ve tRNA gerekir. Bu, genellikle daha büyük miktarlarda numuneyi tüketen alternatif biyofiziksel teknikler üzerinde bir avantajdır.

Jel retardasyon tahlili transkripsiyon faktörlerinin incelenmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Deney, birçok farklı DNA dizisi için transkripsiyon faktörlerinin bağlanma kinetiği, mukavemeti ve özgünlüğünü analiz etmek için kullanılmıştır. Gerçekten de bu alanda EMSA ilk önce 6 , 7 geliştirildi. RNA 8 , 9 , 10 , 11 ve tRNA molekülleri ile jel geciktirme testleri ribozom araştırmasında da kullanılmıştırVe burada yaptığımız gibi, transkripsiyonel olarak tRNA nükleozidlerini değiştiren enzimleri analiz etmek.

Birçok farklı parametre, sıcaklık, protein kalitesi ve tRNA örneği gibi jel retardasyon tahlilinin sonucunu ve bağlanma kuvvetini etkiler. Deneyin dikkatli planlanması ve uygulanması, serbest nükleik asit ve protein bağlı türlerin sonuçlarının yorumlanması için çok önemlidir. Burada, tRNA'yı (UUU) kodlayan sentetik geni, promotörü Shine-Dalgarno ribozom bağlanma yerinden yoksun bir ifade vektörüne klonlandı ve büyük miktarda tRNA 2 sentezine yol açtı. Bu ayrıntılı protokol, yaygın hatalar önlenirken tRNA jel geciktirme deneyleri gerçekleştirmek için net bir kılavuz sağlamak üzere hazırlanmıştır.

Protocol

Dikkat: Kullanmadan önce ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formlarına (MSDS) başvurun. Bu protokolde kullanılan kimyasallardan birçoğu toksik ve aşındırıcıdır. Davlumbaz ve kişisel koruyucu ekipmanlar (emniyet gözlükleri, eldivenler, laboratuar önlükleri, tam pantolonlar, kapalı pabuçlar, vb .) Dahil olmak üzere fenol kullanarak tRNA'nın özümlenmesinde uygun uygulamaları kullanın. Bu protokol, toksik olmayan bir nükleik asit lekesi kullanıyor. Alternatif lekelerin kullanılması…

Representative Results

Büyük miktarda tRNA (UUU), güçlü bir indüklenebilir T7 promotörü kontrolü altında E. coli'de tRNA geninin eksprese edilmesi ile elde edilebilir. İfade edilen tRNA (UUU), sitoplazmada birikir ve doğal olarak bol miktarda bulunan tRNA'ların havuzunda zenginleştirilir. EMSA dereceli tRNA elde etmek için bir yakalama / ekstraksiyon basamağı ve bir jel filtrasyon / parlatma aşaması içeren iki aşamalı bir saflaştırma işlemi kullanılmıştır. Yakalama…

Discussion

Burada tarif edilen protein-tRNA agaroz jel geciktirme deneyi, çeşitli şekillerde modifiye edilebilir. Birincisi, jelin içindeki agaroz yüzdesi, burada analiz edilen protein (120 kDa) 'dan önemli ölçüde daha büyük protein-tRNA komplekslerinin ayrılması ve görselleştirilmesine izin vermek için azaltılabilir. İkincisi, hedef protein termolabilitedeyse, elektroforez cihazını soğuk bir odaya taşıyarak veya üretilen ısıyı derhal dağıtmak için elektroforez haznesi içindeki buz paketlerini ku…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MCV, CIB İleri Düzey Programı "Daha İyi Yaşam için Moleküler Makineler" (MACBET) üyesidir. Bu sonuçlara götüren araştırmalar, İspanyol Enstitü Salud Carlos III (PI12 / 01667'den MCV'ye), İspanya Ekonomi Bakanlığı Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R ve SAF2015-72961-EXP'den MCV'ye) tarafından finanse edildi. ), Madrid Bölge Hükümeti (S2010 / BD-2316'dan MCV'ye) ve Avrupa Komisyonu (Çerçeve Programı 7 (FP7)) projesi olan ComplexINC (Sözleşme No. 279039'dan MCV'ye). Fon sağlayanlar, çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayın yapma kararı veya el yazmasının hazırlanmasında rol oynamadı.

Materials

E. coli BL21(DE3) Novagen 70235 DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction.
pET23d Novagen 69748-3 pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter.
LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated Melford GL1703 Conventional LB Broth, High Salt, can also be used.
Ampicillin Sigma-Aldrich 10419313
Incubator Shaker (Thermostated) NBS Excella E24  Any shaker incubator with temperature control can be used.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% Acros Organics BP1755
Sodium acetate, anhydrous, >99% Melford B4017
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% Acros Organics AC327205000 Harmful if inhaled.
Centrifuge (refrigerated) Eppendorf 5430
Centrifuge (refrigerated) rotor Eppendorf 5430/5430P
Centrifuge Sorvall RC5C
Centrifuge rotor Sorvall SLA-3000
Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 Sigma-Aldrich P4682 Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive
Ethanol absolute for analysis, 100% v/v Merck Millipore 100983
Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% Sigma-Aldrich 71643
Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 Merck 48,730,250
HiLoad 16/60 Superdex 75  GE Healthcare 28989333
Agarose Melford MB1200
Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] Melford T1513
Boric Acid Melford B0503
Microwave Haier HDA-2070M
TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] Sigma-Aldrich C4706 Corrosive to metals and skin.
ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% Sigma-Aldrich A2383
Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% Sigma-Aldrich M8266
Sodium chloride (NaCl), >99% Fisher Bioreagents BP358
Potassium chloride (KCl), >99% Melford P0515
NZYDNA Ladder VI NZYtech MB8901
Power supply Consort EV261
Electrophoresis unit Real Laboratory RELSMINI10
Real Safe nucleic acid staining Real Laboratory RBMSAFE 20,000X stock
UV Transilluminator (G:Box/EF) Syngene 2216498
Coomassie Brilliant Blue G Sigma-Aldrich B0770
Rocker (Gyro-Rocker) Stuart SSL3
Mixer Vortex  Fisher brand 13214789

References

  1. Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
  2. López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).
  3. Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
  4. Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system. J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).
  5. Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
  6. Fried, M. G., Crothers, D. M. Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction. J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).
  7. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
  8. Rio, D. C. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).
  9. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  10. Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).
  11. Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions. Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).
  12. Hagel, L. Gel-filtration chromatography. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).

Play Video

Cite This Article
Fernández, F. J., Gómez, S., Navas-Yuste, S., López-Estepa, M., Vega, M. C. Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function. J. Vis. Exp. (124), e55638, doi:10.3791/55638 (2017).

View Video