Summary

Proteïne-tRNA Agarose Gel Retardatie Assays voor de analyse van de<em> N</em<sup> 6</sup> -threonylcarbamoyladenosine TcdA-functie

Published: June 21, 2017
doi:

Summary

Een protocol wordt gepresenteerd voor de productie van tRNA (UUU) en de analyse van tRNA (UUU) in complex met het enzym TcdA door middel van agarose gel retardatie assays.

Abstract

Wij tonen methoden voor de expressie en zuivering van tRNA (UUU) in Escherichia coli en de analyse door gel-retardatie assays van de binding van tRNA (UUU) tot TcdA, een N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) dehydratase, die de threonylcarbamoyl cycliseert Zijketen verbonden aan A37 in de anticodon stamlus (ASL) van tRNAs tot cyclische t 6 A (ct 6 A). Transcriptie van het synthetische gen dat codeert voor tRNA (UUU) wordt geïnduceerd in E. coli met 1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en de cellen die tRNA bevatten worden 24 uur na inductie geoogst. De RNA fractie wordt gezuiverd met behulp van de methode voor extractie van zure fenolen. Zuiver tRNA wordt verkregen door middel van een gelfiltratiechromatografie die de kleinere tRNA-moleculen efficiënt scheidt van grotere intacte of gefragmenteerde nucleïnezuren. Om TcdA binding aan tRNA (UUU) te analyseren wordt TcdA gemengd met tRNA (UUU) en gescheiden op een native agarosegel bij 4 ° C.De vrije tRNA (UUU) migreert sneller, terwijl de TcdA-tRNA (UUU) complexen een mobiliteitsvertraging ondergaan die kan waargenomen worden bij het kleuren van de gel. We tonen aan dat TcdA een tRNA (UUU) bindend enzym is. Deze gel retardatie assay kan worden gebruikt om TcdA mutanten te bestuderen en de effecten van additieven en andere eiwitten op binding.

Introduction

De gel retardatie assay 1 (ook bekend als elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassay, EMSA) is een elektroforetische methode die is ontworpen om eiwit-nucleïnezuurinteracties te bestuderen en karakteriseren. Het laat de analyse van eiwit-DNA evenals eiwit-RNA-interacties en in het bijzonder interacties tussen tRNA en tRNA-bindende eiwitten toe, met behulp van ofwel gezuiverde componenten of complexe mengsels van eiwitten ( bijvoorbeeld cellysaten) of nucleïnezuren ( bijvoorbeeld tRNA zwembaden). We hebben gelretarderingsbepalingen toegepast op de studie van de interactie tussen gezuiverd tRNA (UUU) en TcdA, een N 6- threonylcarbamoyladenosine (t 6 A) dehydratase, die de threonylcarbamoylzijketen aan A37 in de anticodonstamloop (ASL) cycliseert. Van tRNA's tot cyclisch t6 (ct 6A) 2 , 3 . TcdA staat ook bekend als CsdL 3 ,F "> 4. Het tcdA / csdL- gen vormt een cluster met de csdA- en csdE- genen 5 , die het cysteïne-desulfurase en de zwavelacceptor van het cysteïne-sulfinase-desulfinaat (CSD) -systeem coderen en vereist is om TcdA-functie in vivo 3 te onderhouden.

De redenatie achter de gel retardatie assays is dat, terwijl vrije nucleïnezuurmoleculen snel op de voorkant van acrylamide of agarose gels migreren op grond van hun grote negatieve lading, wordt de elektroforetische mobiliteit van eiwitcomplexen van dezelfde nucleïnezuren dramatisch verminderd. De reductie van mobiliteit wordt weergegeven als een "shift" in de nucleïnezuur-eiwit complexen, die oplossen als discrete banden. Positief geladen en groter nucleïnezuur-eiwit complex laten een grotere verschuiving of vermindering van mobiliteit op een gel zien.

Sinds lading neutralisatie van het complex is een universeel fenomeenVoor eiwit-nucleïnezuur complexen kan de gel retardatie assay worden toegepast op een breed scala van complexen en nucleïnezuur typen. De methode is eenvoudig, goedkoop en kan uitgevoerd worden in laboratoria met minimale apparatuur. Het vereist slechts kleine hoeveelheden eiwitten en tRNA. Dit is een voordeel boven alternatieve biofysische technieken, die meestal grotere hoeveelheden monster verbruiken.

De gel retardatie assay is wijd gebruikt voor de studie van transcriptiefactoren. De analyse is gebruikt om bindende kinetiek, sterkte en specificiteit van transcriptiefactoren voor veel verschillende DNA-sequenties te analyseren. Het was inderdaad op dit gebied dat de EMSA voor het eerst 6 , 7 werd ontwikkeld. Gel retardatie assays met RNA 8 , 9 , 10 , 11 en tRNA moleculen zijn ook gebruikt bij ribosoom onderzoekEn analyseren, zoals we hier doen, de enzymen die tRNA nucleosiden na transcriptie wijzigen.

Veel verschillende parameters beïnvloeden het resultaat van een gel retardatie assay, zoals temperatuur, kwaliteit van het eiwit en tRNA monster, en de sterkte van de binding. Een zorgvuldige planning en uitvoering van het experiment is cruciaal voor de interpretatie van de resultaten van de vrije nucleïnezuur en eiwitgebonden soorten. Hier gebruikten we het synthetische gen dat codeert voor tRNA (UUU) gekloneerd in een expressievector waarvan de promotor de Shine-Dalgarno ribosoom bindingsplaats heeft, die leidt tot de synthese van grote hoeveelheden van de tRNA 2 . Dit gedetailleerde protocol is bedoeld om een ​​duidelijke gids voor het uitvoeren van tRNA gel retardatie experimenten te geven, terwijl gebruikelijke fouten voorkomen.

Protocol

Voorzichtigheid: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) voor gebruik. Verscheidene van de in dit protocol gebruikte chemicaliën zijn giftig en bijtend. Gebruik geschikte praktijken bij het uitvoeren van de extractie van tRNA met behulp van fenol, met inbegrip van het gebruik van een afzuigkap en persoonlijke beschermende uitrusting (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, broek met volledige lengte, gesloten-schoenen, enz .). Dit protocol gebruikt een niet-toxische nucleïnezuurvle…

Representative Results

Grote hoeveelheden tRNA (UUU) kunnen worden verkregen door het tRNA-gen in E. coli te onderdrukken onder de controle van een sterk induceerbare T7 promotor. Het uitgedrukte tRNA (UUU) accumuleert in het cytoplasma en is verrijkt over het zwembad van natuurlijk overvloedige tRNAs. Een tweestapszuiveringsproces bestaande uit een opname- / extractiestap en een gelfiltratie- / polijststap werd gebruikt om EMSA-gehalte tRNA te verkrijgen. De opname- / extractiestap maakt gebruik van …

Discussion

De hierin beschreven eiwit-tRNA agarose gel retardatie-analyse kan op een aantal manieren worden gemodificeerd. Ten eerste kan het percentage agarose in de gel verminderd worden om de scheiding en visualisatie van eiwit-tRNA complexen aanzienlijk groter te maken dan de hier geanalyseerde (120 kDa). Ten tweede, als het doelproteïne thermolabiel is, moeten extra voorzorgsmaatregelen worden genomen om ervoor te zorgen dat de temperatuur onder de maximale aanvaardbare temperatuur wordt gehouden door het elektroforeseappara…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MCV is lid van het CIB Intramurale Programma "Moleculaire Machines voor Beter Leven" (MACBET). Het onderzoek dat leidde tot deze resultaten heeft financiering ontvangen van het Spaanse Instituto de Salud Carlos III (PI12 / 01667 naar MCV), het Spaanse Ministerie van Economie en Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R en SAF2015-72961-EXP naar MCV ), De regionale regering van Madrid (S2010 / BD-2316 tot MCV) en de Europese Commissie (kaderprogramma 7 (KP7)) project ComplexINC (contract nr. 279039 naar MCV). De financiers hadden geen rol in studieontwerp, dataverzameling en analyse, beslissing om te publiceren of voorbereiden van het manuscript.

Materials

E. coli BL21(DE3) Novagen 70235 DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction.
pET23d Novagen 69748-3 pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter.
LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated Melford GL1703 Conventional LB Broth, High Salt, can also be used.
Ampicillin Sigma-Aldrich 10419313
Incubator Shaker (Thermostated) NBS Excella E24  Any shaker incubator with temperature control can be used.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% Acros Organics BP1755
Sodium acetate, anhydrous, >99% Melford B4017
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% Acros Organics AC327205000 Harmful if inhaled.
Centrifuge (refrigerated) Eppendorf 5430
Centrifuge (refrigerated) rotor Eppendorf 5430/5430P
Centrifuge Sorvall RC5C
Centrifuge rotor Sorvall SLA-3000
Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 Sigma-Aldrich P4682 Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive
Ethanol absolute for analysis, 100% v/v Merck Millipore 100983
Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% Sigma-Aldrich 71643
Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 Merck 48,730,250
HiLoad 16/60 Superdex 75  GE Healthcare 28989333
Agarose Melford MB1200
Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] Melford T1513
Boric Acid Melford B0503
Microwave Haier HDA-2070M
TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] Sigma-Aldrich C4706 Corrosive to metals and skin.
ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% Sigma-Aldrich A2383
Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% Sigma-Aldrich M8266
Sodium chloride (NaCl), >99% Fisher Bioreagents BP358
Potassium chloride (KCl), >99% Melford P0515
NZYDNA Ladder VI NZYtech MB8901
Power supply Consort EV261
Electrophoresis unit Real Laboratory RELSMINI10
Real Safe nucleic acid staining Real Laboratory RBMSAFE 20,000X stock
UV Transilluminator (G:Box/EF) Syngene 2216498
Coomassie Brilliant Blue G Sigma-Aldrich B0770
Rocker (Gyro-Rocker) Stuart SSL3
Mixer Vortex  Fisher brand 13214789

References

  1. Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
  2. López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).
  3. Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
  4. Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system. J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).
  5. Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
  6. Fried, M. G., Crothers, D. M. Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction. J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).
  7. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
  8. Rio, D. C. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).
  9. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  10. Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).
  11. Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions. Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).
  12. Hagel, L. Gel-filtration chromatography. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).

Play Video

Cite This Article
Fernández, F. J., Gómez, S., Navas-Yuste, S., López-Estepa, M., Vega, M. C. Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function. J. Vis. Exp. (124), e55638, doi:10.3791/55638 (2017).

View Video