タンパク質分析のためのタンパク質tRNAアガロースゲルリターデーションアッセイ<em> N</em⁶ - スルホニルカルバモイルアデノシンTcdA機能

ゲル遅延アッセイ¹ （電気泳動移動度シフトアッセイ、EMSAとしても知られている）は、タンパク質 – 核酸相互作用を研究し特徴付けるために設計された電気泳動法である。これは、精製された成分またはタンパク質（ 例えば 、細胞溶解物）または核酸（ 例えば 、tRNA）の複雑な混合物のいずれかを用いて、タンパク質-DNAならびにタンパク質-RNA相互作用ならびに特にtRNAとtRNA結合タンパク質との相互作用の分析を可能にするプール）。本発明者らは、精製tRNA（UUU）とアンチコドンステムループ（ASL）においてA37に結合したトレオニルカルバモイル側鎖を環化するN ^{6 –}トレノニルカルバモイルアデノシン（t ⁶ A）デヒドラターゼであるTcdAとの相互作用の研究にゲル遅延アッセイを適用した。 tRNAの環状t ⁶ （ct ⁶ A） ^2への変換。 TcdAはCsdL ³としても知られており^、tcdA / csdL遺伝子は、 csdAおよびcsdE遺伝子⁵を有するクラスターを形成し、システインスルフリナーゼ脱硫酵素（CSD）系のシステインデスルフラーゼおよび硫黄受容体をコードし、 インビボで TcdA機能を維持する必要がある³ 。

ゲル遅延アッセイの背後にある論理的根拠は、遊離核酸分子は、その大きな負電荷のためにアクリルアミドまたはアガロースゲルの前面に迅速に移動するが、同じ核酸のタンパク質複合体の電気泳動移動度は劇的に減少するということである。移動度の減少は、核酸 – タンパク質複合体における「シフト」として視覚化され、これは別個のバンドとして解決する。正に帯電した、より大きな核酸 – タンパク質複合体は、ゲル上の移動度のより大きなシフトまたは減少を示す。

複合体の電荷中和は普遍的な現象であるためタンパク質 – 核酸複合体については、ゲル遅延アッセイを広範囲の複合体および核酸型に適用することができる。この方法は、単純で安価であり、最小限の設備で実験室で実施することができる。少量のタンパク質とtRNAしか必要としません。これは、通常はより多くの量の試料を消費する代替的な生物物理学的技術に対して利点である。

ゲル遅延アッセイは、転写因子の研究に広く使用されている。アッセイは、多くの異なるDNA配列の転写因子の結合動力学、強度および特異性を分析するために用いられてきた。この分野では、EMSAが最初に開発されたのは確か^{6,7であった} 。 RNA 8,9,10,11およびtRNA分子を用いたゲル遅延アッセイもリボソーム研究に用いられている我々がここで行ったように、転写後にtRNAヌクレオシドを修飾する酵素を分析することである。

多くの異なるパラメーターが、温度、タンパク質およびtRNAサンプルの品質、および結合の強さなどのゲル遅延アッセイの結果に影響を及ぼす。実験の慎重な計画と実行は、遊離核酸とタンパク質結合種の結果の解釈にとって非常に重要です。ここでは、プロモーターがShine-Dalgarnoリボソーム結合部位を欠く発現ベクターにクローニングされたtRNA（UUU）をコードする合成遺伝子を使用し、大量のtRNA ^2の合成を導く。この詳細なプロトコールは、一般的なミスを避けながらtRNAゲル遅延実験を行うための明確なガイドを提供することを意図している。