Summary

Analisi del rallentamento del gel agarosio proteina-tRNA per l'analisi del<em> N</em<sup> 6</sup> -reonilcarbamoyladenosine TcdA Funzione

Published: June 21, 2017
doi:

Summary

Viene presentato un protocollo per la produzione di tRNA (UUU) e l'analisi di tRNA (UUU) in complesso con l'enzima TcdA mediante saggi di retardazione del gel agarosio.

Abstract

Esistono metodi per l'espressione e la purificazione di tRNA (UUU) in Escherichia coli e l'analisi mediante test di ritardo di gel del legame di tRNA (UUU) a TcdA, una N 6 -reonilcarbamoyladenosina (t 6 A) deidratasi che ciclizza il treonilcarbamoil La catena laterale attaccata ad A37 nel loop di gambo anticodon (ASL) di tRNA a ciclica t 6 A (ct 6 A). La transcrizione del gene sintetico che codifica il tRNA (UUU) è indotta in E. coli con 1 mM isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) e le cellule contenenti tRNA vengono raccolte 24 h postinduzione. La frazione RNA viene purificata usando il metodo di estrazione di fenolo acido. Il tRNA puro viene ottenuto mediante una cromatografia di filtrazione a gel che effettua la separazione efficiente delle molecole di tRNA di piccole dimensioni dai più grandi acidi nucleici intatti o frammentati. Per analizzare il legame TcdA a tRNA (UUU), TcdA viene mescolato con tRNA (UUU) e separato su un gel agarosico nativo a 4 ° C.Il tRNA libero (UUU) migra più velocemente, mentre i complessi TcdA-tRNA (UUU) subiscono un ritardo di mobilità che può essere osservato durante la colorazione del gel. Abbiamo dimostrato che TcdA è un enzima tRNA (UUU) -binding. Questo test di ritardo di gel può essere utilizzato per studiare mutanti TcdA e gli effetti degli additivi e di altre proteine ​​sul legame.

Introduction

Il saggio di ritardo di gel 1 (noto anche come test di spostamento di mobilità elettroforetica, EMSA) è un metodo elettroforetico progettato per studiare e caratterizzare le interazioni proteiche-acido nucleico. Permette di analizzare le proteine-DNA e le interazioni proteine-RNA e in particolare le interazioni tra tRNA e proteine ​​leganti tRNA, utilizzando componenti purificati o miscele complesse di proteine ​​( ad es. , Lisati cellulari) o acidi nucleici ( ad esempio tRNA piscine). Abbiamo applicato saggi di retardazione del gel allo studio dell'interazione tra tRNA purificato (UUU) e TcdA, una N 6 -reonilcarbamoyladenosina (t 6 A) deidratasi, che ciclizza la catena laterale di treonilcarbamoil attaccata ad A37 nel ciclo anticodonale (ASL) Di tRNA a ciclica t 6 (ct 6 A) 2 , 3 . TcdA è anche conosciuto come CsdL 3 ,F "> 4. Il gene tcdA / csdL forma un cluster con i geni 5 e 5 che codificano la cisteina desulfurasi e l'acquirente dello zolfo del sistema cisina sulfinasi desulfinato (CSD) ed è richiesto per sostenere la funzione TcdA in vivo 3 .

La ragione dietro i test di retardazione del gel è che, mentre le molecole di acido nucleico libere migrano rapidamente alla parte anteriore di acrilammide o gel agarosio in virtù della loro grande carica negativa, la mobilità elettroforetica dei complessi proteici degli stessi acidi nucleici è drasticamente ridotta. La riduzione della mobilità è visualizzata come un "spostamento" nei complessi proteici dell'acido nucleico, che risolvono come bande discrete. Il complesso proteico acido nucleico caricato e maggiormente mostrato mostra un maggiore spostamento o riduzione della mobilità su un gel.

Poiché la neutralizzazione del carico del complesso è un fenomeno universalePer i complessi di acido nucleico proteico, il saggio di retardazione del gel può essere applicato ad una vasta gamma di complessi e tipi di acido nucleico. Il metodo è semplice, poco costoso e può essere condotto in laboratori con attrezzature minime. Richiede solo piccole quantità di proteine ​​e tRNA. Questo è un vantaggio rispetto alle tecniche biofisiche alternative, che di solito consumano grandi quantità di campioni.

Il saggio di retardazione del gel è stato ampiamente usato per lo studio dei fattori di trascrizione. Il saggio è stato utilizzato per analizzare la cinetica legante, la forza e la specificità dei fattori di trascrizione per molte sequenze di DNA diverse. Fu proprio in questo campo che l'EMSA fu per la prima volta sviluppata 6 , 7 . I test di ritardo di gel con RNA 8 , 9 , 10 , 11 e molecole di tRNA sono stati utilizzati anche nella ricerca di ribosomiE di analizzare, come facciamo qui, gli enzimi che modificano i nucleosidi del tRNA post-trascrizionale.

Molti parametri diversi influenzano il risultato di un test di ritardo di gel come la temperatura, la qualità della proteina e il campione tRNA e la forza del legame. La pianificazione e l'esecuzione attenta dell'esperimento è fondamentale per l'interpretazione dei risultati delle specie libere di acido nucleico e proteine. Qui abbiamo usato il tRNA (UUU) codificante gene sintetico clonato in un vettore di espressione il cui promotore manca del sito di legame dei ribosomi Shine-Dalgarno, portando alla sintesi di grandi quantità del tRNA 2 . Questo protocollo dettagliato è inteso a fornire una guida chiara per eseguire esperimenti di ritardo del tRNA gel evitando errori comuni.

Protocol

Attenzione: Prima dell'uso consultare tutte le schede tecniche di sicurezza relative ai materiali (MSDS). Molte delle sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo sono tossiche e corrosive. Utilizzare pratiche appropriate quando si esegue l'estrazione di tRNA utilizzando fenolo, incluso l'uso di un cappuccio e delle attrezzature di protezione individuale (occhiali di sicurezza, guanti, cappotto di laboratorio, pantaloni lunghi, scarpe chiuse, ecc .). Questo protocollo utilizza una macchia acida…

Representative Results

Grandi quantità di tRNA (UUU) possono essere ottenute esprimendo il gene tRNA in E. coli sotto il controllo di un forte promotore T7 inducibile. L'espresso tRNA (UUU) si accumula nel citoplasma e si arricchisce sulla piscina di tRNA naturali abbondanti. Un procedimento di purificazione a due fasi costituito da una fase di cattura / estrazione e una fase di filtrazione / lucidatura gel è stata utilizzata per ottenere il tRNA di grado EMSA. La fase di cattura / estrazione ut…

Discussion

Il saggio di retardazione del gel agarosico di proteina-tRNA descritto qui può essere modificato in diversi modi. In primo luogo, la percentuale di agarosio nel gel può essere ridotta per consentire la separazione e la visualizzazione di complessi proteina-tRNA significativamente più grandi di quelli analizzati qui (120 kDa). In secondo luogo, se la proteina bersaglio è termolabile, occorre prendere ulteriori precauzioni per garantire che la temperatura sia mantenuta al di sotto della massima temperatura accettabile…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MCV è membro del programma CIB Intramural "Macchine Molecolari per una migliore vita" (MACBET). La ricerca che ha portato a questi risultati è stato finanziato dall'ente spagnolo Instituto de Salud Carlos III (PI12 / 01667 a MCV), dal ministero spagnolo de Economía y Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R e SAF2015-72961-EXP alla MCV ), Il governo regionale di Madrid (S2010 / BD-2316 a MCV) e la Commissione europea (Programma quadro 7 (FP7)) il progetto ComplexINC (contratto n. 279039 a MCV). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta di dati e nell'analisi, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

Materials

E. coli BL21(DE3) Novagen 70235 DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction.
pET23d Novagen 69748-3 pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter.
LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated Melford GL1703 Conventional LB Broth, High Salt, can also be used.
Ampicillin Sigma-Aldrich 10419313
Incubator Shaker (Thermostated) NBS Excella E24  Any shaker incubator with temperature control can be used.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% Acros Organics BP1755
Sodium acetate, anhydrous, >99% Melford B4017
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% Acros Organics AC327205000 Harmful if inhaled.
Centrifuge (refrigerated) Eppendorf 5430
Centrifuge (refrigerated) rotor Eppendorf 5430/5430P
Centrifuge Sorvall RC5C
Centrifuge rotor Sorvall SLA-3000
Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 Sigma-Aldrich P4682 Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive
Ethanol absolute for analysis, 100% v/v Merck Millipore 100983
Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% Sigma-Aldrich 71643
Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 Merck 48,730,250
HiLoad 16/60 Superdex 75  GE Healthcare 28989333
Agarose Melford MB1200
Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] Melford T1513
Boric Acid Melford B0503
Microwave Haier HDA-2070M
TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] Sigma-Aldrich C4706 Corrosive to metals and skin.
ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% Sigma-Aldrich A2383
Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% Sigma-Aldrich M8266
Sodium chloride (NaCl), >99% Fisher Bioreagents BP358
Potassium chloride (KCl), >99% Melford P0515
NZYDNA Ladder VI NZYtech MB8901
Power supply Consort EV261
Electrophoresis unit Real Laboratory RELSMINI10
Real Safe nucleic acid staining Real Laboratory RBMSAFE 20,000X stock
UV Transilluminator (G:Box/EF) Syngene 2216498
Coomassie Brilliant Blue G Sigma-Aldrich B0770
Rocker (Gyro-Rocker) Stuart SSL3
Mixer Vortex  Fisher brand 13214789

References

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Fernández, F. J., Gómez, S., Navas-Yuste, S., López-Estepa, M., Vega, M. C. Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function. J. Vis. Exp. (124), e55638, doi:10.3791/55638 (2017).

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