البروتين الحمض الريبي النووي النقال - أغروز فحوصات جل التخلف عن تحليل<em> N</em<sup> 6</sup> -threonylcarbamoyladenosine وظيفة تددا
Summary
ويرد بروتوكول لإنتاج الحمض الريبي النووي النقال (وو) وتحليل الحمض الريبي النووي النقال (ووو) في مجمع مع تسدا انزيم من قبل الاغاروز فحوصات التخلف هلام.
Abstract
علينا أن نظهر أساليب للتعبير وتنقية الحمض الريبي النووي النقال (أوو) في الإشريكية القولونية والتحليل من خلال المقايسات التخلف هلام من ربط الحمض الريبي النووي النقال (أوو) إلى تسدا، و N 6 -threonylcarbamoyladenosine (ر 6 A) ديهيدراتاس، الذي سيكليزس ثريونيلكاربامويل سلسلة جانبية تعلق على A37 في حلقة الجذعية أنتيكودون (أسل) من ترناس إلى دوري T 6 A (كت 6 A). ويتسبب النسخ من ترميز الحمض الريبي النووي النقال ترميز الحمض النووي الريبي (أوو) في E. القولونية مع 1 ملي الآيزوبروبيل β-D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (إيبت) ويتم حصاد الخلايا التي تحتوي على الحمض الريبي النووي النقال 24 ساعة بعد الاستقراء. يتم تنقية جزء الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة استخراج الفينول حمض. يتم الحصول على الحمض الريبي النووي النقال النقي من قبل اللوني الترشيح هلام أن يفصل بكفاءة الجزيئات الحمض الريبي النووي النقال صغيرة الحجم من أكبر الأحماض النووية سليمة أو مجزأة. لتحليل تسدا ملزمة ل الحمض الريبي النووي النقال (وو)، يتم خلط تسدا مع الحمض الريبي النووي النقال (وو) وفصلها على هلام الاغاروز الأصلي في 4 درجات مئوية.الحمض الريبي النووي النقال مجانا (وو) يهاجر بشكل أسرع، في حين أن المجمعات تسدا-ترنا (وو) تخضع للتخلف التنقل التي يمكن ملاحظتها عند تلطيخ هلام. علينا أن نظهر أن تسدا هو الحمض الريبي النووي النقال (وو) – انزيم ملزمة. هذا الفحص هلام التخلف يمكن استخدامها لدراسة المسوخ تسدا وآثار الإضافات والبروتينات الأخرى على ملزمة.
Introduction
اختبار التخثر هلام 1 (المعروف أيضا باسم التحولات الكهربي التحول التحول، إمزا) هو طريقة إليكتروفوريتيك مصممة لدراسة وتوصيف التفاعلات حمض البروتين النووي. فإنه يسمح لتحليل البروتين الحمض النووي، فضلا عن التفاعلات البروتين رنا وعلى وجه الخصوص، والتفاعلات بين الحمض الريبي النووي النقال والبروتينات ملزمة الحمض الريبي النووي النقال، وذلك باستخدام إما مكونات تنقية أو مخاليط معقدة من البروتينات (على سبيل المثال ، خلية لستيس) أو الأحماض النووية (على سبيل المثال ، الحمض الريبي النووي النقال حمامات). لقد قمنا بتطبيق مقايسات التخلف هلام لدراسة التفاعل بين الحمض الريبي النووي النقال المنقى (وو) و تسدا، و N 6- ثريونيلكاربامويلادينوسين (ر 6 A) ديهيدراتاز، الذي سيكليزس سلسلة جانبية ثريونيلكاربامويل تعلق على A37 في حلقة الجذعية أنتيكودون (أسل) من ترناس إلى دوري t 6 (ط 6 أ) 2 ، 3 . ومن المعروف أيضا تسدا كما سدل 3 ،f "> 4. يشكل الجين تسدا / كسدل كتلة مع جينات كسدا و كسد 5 ، التي ترميز ديسولفورياز السيستين والمتقبل الكبريت من سيستين سلفيناز ديسولفينات (كسد) النظام ومطلوب للحفاظ على وظيفة تكدا في الجسم الحي 3 .
الأساس المنطقي وراء المقايسات التخلف هلام هو أنه في حين أن جزيئات الحمض النووي الحرة تهاجر بسرعة إلى الجزء الأمامي من المواد الهلامية الأكريلاميد أو الاغاروز بحكم تهمة سلبية كبيرة، والتنقل الكهربي من المجمعات البروتين من نفس الأحماض النووية هو انخفاض كبير. يتم تصور الانخفاض في التنقل باعتباره "التحول" في المجمعات الحمض النووي البروتين، والتي حلت كما العصابات منفصلة. المشحونة إيجابيا وأكبر مجمع الحمض النووي البروتين تظهر زيادة التحول أو الحد في التنقل على هلام.
منذ تهمة تهمة المجمع هو ظاهرة عالميةلمجمعات حمض البروتين النووي، ويمكن تطبيق فحص التخثر هلام لمجموعة واسعة من المجمعات وأنواع الحمض النووي. طريقة بسيطة وغير مكلفة، ويمكن إجراءها في المختبرات مع الحد الأدنى من المعدات. فإنه يتطلب كميات صغيرة فقط من البروتينات والحمض النووي الريبي. وهذه ميزة على التقنيات الفيزيائية الحيوية البديلة التي تستهلك عادة كميات أكبر من العينة.
وقد استخدمت على نطاق واسع اختبار التخلف هلام لدراسة عوامل النسخ. وقد استخدمت مقايسة لتحليل حركية ملزمة، والقوة، وخصوصية عوامل النسخ للعديد من تسلسل الحمض النووي المختلفة. وكان في الواقع في هذا المجال أن إمسا وضعت لأول مرة 6 ، 7 . وقد استخدمت أيضا فحوصات التخلف هلام مع رنا 8 ، 9 ، 10 ، 11 والجزيئات الحمض الريبي النووي النقال في البحوث الريبوسوموتحليل، كما نفعل هنا، الإنزيمات التي تعدل نوكلأوسيدس الحمض الريبي النووي النقال بعد ترانسكريبتيونالي.
العديد من المعلمات المختلفة تؤثر على نتيجة لفحص هلام التخلف مثل درجة الحرارة، ونوعية البروتين وعينة الحمض الريبي النووي النقال، وقوة ملزمة. التخطيط الدقيق وتنفيذ التجربة أمر حاسم لتفسير نتائج الحمض النووي الحرة والأنواع المرتبطة بالبروتين. هنا، استخدمنا الجين الاصطناعية ترنا الحمض الريبي النووي النقال (أوو) المستنسخة في ناقلات التعبير الذي يفتقر المروج على شاين دالغارنو ريبوسوم موقع ملزم، مما يؤدي إلى تخليق كميات كبيرة من الحمض الريبي النووي النقال 2 . ويهدف هذا البروتوكول مفصل لتوفير دليل واضح لأداء الحمض النووي الريبي الحمض النووي الريبي التخلف التجارب مع تجنب الأخطاء الشائعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويمكن تعديل البروتين الحمض الريبي النووي النقال الاغاروز مقايسة التخثر هلام وصفها هنا في عدد من الطرق. أولا، يمكن تخفيض نسبة الاغاروز في هلام للسماح للفصل والتصور من المجمعات البروتين الحمض الريبي النووي النقال أكبر بكثير من واحد تحليلها هنا (120 كيلو دالتون). ثانيا، …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
مكف هو عضو في برنامج سيب الداخلي "الآلات الجزيئية لحياة أفضل" (ماكبيت). وقد تلقت البحوث المؤدية إلى هذه النتائج تمويلا من المعهد الإسباني للسلود كارلوس الثالث (PI12 / 01667 إلى مكف)، والوزارة الإسبانية دي إكونوميا y كومبيتيتيفيداد (CTQ2015-66206-C2-2-R و SAF2015-72961-إكس إلى مكف )، والحكومة الإقليمية في مدريد (S2010 / بد-2316 إلى مكف)، والمفوضية الأوروبية (برنامج الإطار 7 (FP7)) كومبليكسينك (العقد رقم 279039 إلى مكف). ولم يكن للممولين دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليلها، أو قرار نشرها، أو إعداد المخطوطة.
Materials
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter. |
| LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated | Melford | GL1703 | Conventional LB Broth, High Salt, can also be used. |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| Incubator Shaker (Thermostated) | NBS | Excella E24 | Any shaker incubator with temperature control can be used. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Sodium acetate, anhydrous, >99% | Melford | B4017 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Harmful if inhaled. |
| Centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5430 | |
| Centrifuge (refrigerated) rotor | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Centrifuge | Sorvall | RC5C | |
| Centrifuge rotor | Sorvall | SLA-3000 | |
| Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive |
| Ethanol absolute for analysis, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] | Melford | T1513 | |
| Boric Acid | Melford | B0503 | |
| Microwave | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosive to metals and skin. |
| ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium chloride (NaCl), >99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| Potassium chloride (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Power supply | Consort | EV261 | |
| Electrophoresis unit | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe nucleic acid staining | Real Laboratory | RBMSAFE | 20,000X stock |
| UV Transilluminator (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Fisher brand | 13214789 |
References
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).
- Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
- Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system. J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).
- Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
- Fried, M. G., Crothers, D. M. Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction. J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Rio, D. C. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).
- Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions. Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).
- Hagel, L. Gel-filtration chromatography. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
