Se presenta un protocolo para la producción de tRNA (UUU) y el análisis de tRNA (UUU) en complejo con la enzima TcdA mediante ensayos de retardo de gel de agarosa.
Demostramos métodos para la expresión y purificación de tRNA (UUU) en Escherichia coli y el análisis por ensayos de retardo de gel de la unión de tRNA (UUU) a TcdA, una N6-treonilcarbamoilandenosina (t6A) deshidratasa, que cicla el treonilcarbamoil Cadena lateral unida a A37 en el lazo del vástago anticodon (ASL) de tRNAs a t 6 A cíclico (ct 6 A). La transcripción del gen sintético que codifica el ARNt (UUU) se induce en E. coli con 1 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) y las células que contienen ARNt se recogen 24 h después de la inducción. La fracción de ARN se purifica utilizando el método de extracción con fenol ácido. El ARNt puro se obtiene mediante una cromatografía de filtración en gel que separa eficientemente las moléculas de tRNA de tamaño pequeño de ácidos nucleicos más grandes o intactos o fragmentados. Para analizar TcdA vinculante a tRNA (UUU), TcdA se mezcla con tRNA (UUU) y se separó en un nativo gel de agarosa a 4 ° C.El tRNA libre (UUU) migra más rápidamente, mientras que los complejos TcdA-tRNA (UUU) experimentan un retraso de la movilidad que se puede observar al teñir el gel. Se demuestra que TcdA es un tRNA (UUU) de unión a la enzima. Este ensayo de retardo de gel puede usarse para estudiar los mutantes de TcdA y los efectos de los aditivos y otras proteínas en la unión.
El ensayo de retraso del gel 1 (también conocido como ensayo de cambio de movilidad electroforética, EMSA) es un método electroforético diseñado para estudiar y caracterizar las interacciones proteína-ácido nucleico. Permite el análisis de las interacciones proteína-ADN, así como proteína-ARN y en particular, las interacciones entre las proteínas de unión a tRNA y ARNt, utilizando componentes purificados o mezclas complejas de proteínas ( por ejemplo , lisados celulares) o ácidos nucleicos ( por ejemplo , ARNt quinielas). Hemos aplicado ensayos de retardo de gel al estudio de la interacción entre tRNA purificado (UUU) y TcdA, una N6-treonilcarbamoyladenosina (t 6 A) deshidratasa, que cicla la cadena lateral de treonilcarbamoilo unida a A37 en el bucle anticodon del tallo (ASL) De tRNAs a t 6 cíclico (ct 6 A) 2 , 3 . TcdA es también conocido como CsdL 3 ,El gen tcdA / csdL forma un grupo con los genes csdA y csdE 5 , que codifican la cisteína desulfurasa y el aceptor de azufre del sistema de cysteine sulfinase desulfinate (CSD) y se requiere para sostener la función TcdA in vivo [ 3] .
La razón detrás de los ensayos de retardación de gel es que, mientras que las moléculas de ácidos nucleicos libres migran rápidamente al frente de geles de acrilamida o agarosa en virtud de su gran carga negativa, la movilidad electroforética de complejos de proteínas de los mismos ácidos nucleicos se reduce drásticamente. La reducción de la movilidad se visualiza como un "cambio" en los complejos ácido nucleico-proteína, que se resuelven como bandas discretas. El complejo de ácido nucleico-proteína con carga positiva y mayor muestra un mayor cambio o reducción en la movilidad en un gel.
Dado que la neutralización de carga del complejo es un fenómeno universalPara complejos proteína-ácido nucleico, el ensayo de retardo de gel se puede aplicar a una amplia gama de complejos y tipos de ácidos nucleicos. El método es simple, económico y se puede realizar en laboratorios con un equipo mínimo. Requiere sólo pequeñas cantidades de proteínas y tRNA. Esta es una ventaja sobre las técnicas biofísicas alternativas, que usualmente consumen mayores cantidades de muestra.
El ensayo de retardo de gel ha sido ampliamente utilizado para el estudio de factores de transcripción. El ensayo se ha utilizado para analizar la cinética de unión, la resistencia y la especificidad de los factores de transcripción para muchas secuencias de ADN diferentes. Fue precisamente en este campo que se desarrolló por primera vez la EMSA 6 , 7 . También se han utilizado ensayos de retardo de gel con moléculas de ARN 8 , 9 , 10 , 11 y tRNA en la investigación de ribosomasY analizar, como aquí, las enzimas que modifican nucleósidos de tRNA post-transcripcional.
Muchos parámetros diferentes afectan el resultado de un ensayo de retardo de gel, tal como la temperatura, la calidad de la proteína y la muestra de ARNt, y la resistencia de la unión. La planificación cuidadosa y la ejecución del experimento son cruciales para la interpretación de los resultados del ácido nucleico libre y de las especies ligadas a proteínas. Aquí, se utilizó el gen sintético que codifica tRNA (UUU) clonado en un vector de expresión cuyo promotor carece de la Shine-Dalgarno ribosoma sitio de unión, lo que conduce a la síntesis de grandes cantidades de tRNA 2 . Este protocolo detallado pretende proporcionar una guía clara para realizar experimentos de retardo de gel tRNA mientras se evitan errores comunes.
El ensayo de retardo de gel de proteína-ARNt-agarosa descrito en el presente documento puede modificarse de varias maneras. En primer lugar, el porcentaje de agarosa en el gel puede reducirse para permitir la separación y visualización de complejos proteína-ARNt significativamente mayores que el analizado aquí (120 kDa). En segundo lugar, si la proteína diana es termolábil, se deben tomar precauciones adicionales para asegurar que la temperatura se mantiene por debajo de la temperatura máxima aceptable moviendo …
The authors have nothing to disclose.
MCV es miembro del Programa Intramural CIB "Máquinas Moleculares para una Vida Mejor" (MACBET). La investigación que condujo a estos resultados ha sido financiada por el Instituto de Salud Carlos III (PI12 / 01667 a MCV), el Ministerio de Economía y Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R y SAF2015-72961-EXP a MCV) ), El Gobierno Regional de Madrid (S2010 / BD-2316 a MCV) y el proyecto ComplexINC (Contrato nº 279039 a MCV) de la Comisión Europea (Programa Marco 7 (FP7)). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction. |
pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter. |
LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated | Melford | GL1703 | Conventional LB Broth, High Salt, can also be used. |
Ampicillin | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
Incubator Shaker (Thermostated) | NBS | Excella E24 | Any shaker incubator with temperature control can be used. |
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
Sodium acetate, anhydrous, >99% | Melford | B4017 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Harmful if inhaled. |
Centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5430 | |
Centrifuge (refrigerated) rotor | Eppendorf | 5430/5430P | |
Centrifuge | Sorvall | RC5C | |
Centrifuge rotor | Sorvall | SLA-3000 | |
Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive |
Ethanol absolute for analysis, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
Agarose | Melford | MB1200 | |
Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] | Melford | T1513 | |
Boric Acid | Melford | B0503 | |
Microwave | Haier | HDA-2070M | |
TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosive to metals and skin. |
ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Sodium chloride (NaCl), >99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
Potassium chloride (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
Power supply | Consort | EV261 | |
Electrophoresis unit | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
Real Safe nucleic acid staining | Real Laboratory | RBMSAFE | 20,000X stock |
UV Transilluminator (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
Mixer Vortex | Fisher brand | 13214789 |