Evaluating Primary Blast Effects <em>In Vitro</em>

Niall J. Logan; Hari Arora; Claire A. Higgins

doi:10.3791/55618

JoVE Journal > Bioengineering

Bioengineering

Avaliar impacto efeitos In Vitro

Published: September 18, 2017

doi:

10.3791/55618

Niall J. Logan¹, Hari Arora¹, Claire A. Higgins¹

¹Department of Bioengineering,Imperial College London

Summary

Compreensão de como as células são moduladas pela exposição a ondas de choque pode ajudar a identificar os mecanismos subjacentes lesões acionados por eventos de explosão. Este protocolo usa equipamento de tubo de choque custom-built para aplicar as ondas de choque em uma gama de pressões de monocamadas de células e identificar os efeitos subsequentes na viabilidade celular.

Abstract

Exposição a eventos de explosão pode causar trauma grave de órgãos vitais como os pulmões, ouvidos e cérebro. Compreender os mecanismos por trás de tais ferimentos induzida a explosão é de grande importância, tendo em conta a recente tendência para a utilização de explosivos em modern warfare e incidentes relacionados ao terrorista. Para entender completamente a lesão induzida pela explosão, nós deve primeiro ser capazes de replicar tais eventos de explosão em um ambiente controlado, usando um método reprodutível. Esta técnica usando equipamento de tubo de choque, as ondas de choque em uma gama de pressões podem ser propagadas sobre células vivas cultivadas em 2D e marcadores de viabilidade celular podem ser imediatamente analisados usando um ensaio de indicador redox e a imagem fluorescente de células vivas e mortas. Este método demonstrou que aumentando a sobrepressão de explosão de pico para 127 kPa pode estimular uma significativa queda na viabilidade celular quando comparados aos controles não tratados. Amostras de teste não estão limitadas a células aderentes, mas pode incluir suspensões celulares, amostras de tecido e todo o corpo, através de pequenas modificações para a instalação de tubo de choque. Replicar as condições exatas que tecidos e células experimentam quando expostos a um evento de explosão genuíno é difícil. Técnicas como o apresentado neste artigo podem ajudar a definir limiares de dano e identificar as alterações epigenéticas e transcriptional dentro das células resultantes de exposição de ondas de choque.

Introduction

Com a recente tendência para a utilização de dispositivos explosivos improvisados em modern warfare e ações terroristas contra civis, compreender os efeitos de eventos explosivos no corpo humano é de grande importância. Ferimentos obtidos através da exposição a eventos de explosão podem ser mortal e letal, com os processos físicos de lesão a ser divididos em quatro categorias. Resultado de lesões primárias de exposição directa para a onda da explosão, que interage com o corpo localmente de forma compressiva e posteriormente expansiva, causando a ruptura de membranas e tecidos moles¹. Lesões secundárias incluem trauma contuso ou penetrante feridas causadas pelo impacto com objetos de baixa massa impelidos a alta velocidade pela onda de explosão. Lesões terciárias ocorrem quando a onda da explosão tem energia suficiente para lançar objetos de massa alta ou indivíduos contra objetos. Por último, lesões de explosão quaternária são definidos por outros diversos ferimentos que não cabem as outras categorias, tais como queimaduras flash². Após exposição a tais eventos de explosão, lesões primárias incluem⁵⁴^,³^,do lesão cerebral traumática, ossificação heterotópica⁶^,⁷, explosão de lesão pulmonar⁸, perda de audição ⁹e os outros¹⁰.

Uma forma de onda observada comumente de eventos de explosão é a onda de Friedlander, representando uma explosão de campo livre, em oposição a um espaço fechado. A forma de onda é composto por uma frente de explosão que pode ser definida como um aumento afiado e rápido da pressão positiva. Isto é seguido imediatamente por um vento de explosão de ar se movendo em alta velocidade e uma onda de liberação que reduz a pressão para abaixo dos níveis atmosféricos. Um vácuo parcial é deixado na região da explosão inicial, que resulta no lento refluxo de ar. As fases positivas e negativas da onda (figura 1A) resultam no movimento de encaixe da explosão onda¹. Para ajudar a elucidar os mecanismos por trás de lesões de impacto, modelos experimentais foram criados para produzir formas de onda, tais como a onda de Friedlander, que células e tecidos terá de enfrentar quando exposta a um evento de explosão genuíno. Atuais sistemas listados na literatura incluem choque tubos¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷, barochambers¹⁸^,¹⁹, o Kolsky bar²⁰, explosão avançados simuladores²¹, o Split Hopkinson pressão bar²²e a recriação de eventos alternativos de explosão em um ambiente controlado usando Tetranitrato de pentaeritritol²³. Apesar da ampla gama de modelos disponíveis, muitas variáveis influenciam o prejuízo obtido a partir de ondas de explosão, incluindo o pré-estresse aplicado e as propriedades mecânicas do, os tipos de células individuais ou tecidos sob avaliação²⁴. Enquanto o estudo de tecidos ou órgãos pode lançar luz sobre a deformação do tecido e brutas alterações morfológicas sofridas como resultado de eventos de explosão, análise a nível celular pode revelar alterações epigenéticas e transcriptional influenciadas pela onda de choque.

Este artigo de métodos descreve uma técnica para propagar ondas de choque em uma gama de pressões sobre células vivas em uma monocamada. Isto permite a caracterização imediata da viabilidade celular, elucidar os limiares de dano potencial das ondas de choque. Além disso, células viáveis podem ser retornadas para as condições de cultura padrão, e podem ser avaliados a longo prazo efeitos biológicos do evento explosão. O protocolo abaixo descreve duas técnicas de viabilidade celular que podem ser usadas em células em cultura.

Figura 1: Aproximação de uma onda de Friedlander. (A) uma aproximação de uma onda de Friedlander observada no sensor 3 do tubo de choque. (B) dados representativos mostrando os perfis diferentes de pressão observados em sensores, 1, 2 e 3 do tubo de choque. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

1. cultura de células e preparação da amostra obter uma linha de célula apropriada (por exemplo, as células da papila dérmica). Nota: O protocolo atual foi concebido para células aderentes, com fibroblastos de papila dérmica de rato isolados de vibrissae usado como um modelo. Cultura de células em um frasco de T-75 contendo o mínimo essencial médio (MEM) α suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% penicilina estreptomicina. Manter as células em condições de cultura padrão de 37 ° C e 5% de CO 2 em um ambiente umidificado até atingirem 80% confluência. o meio de aspirar e lavar duas vezes as células Dulbecco ' s fosfato salino (PBS). Dissociar as células do recipiente incubando-os em 2 mL de tripsina/EDTA na cultura padrão condições 5 min. verificar brevemente para assegurar que as células com êxito tem dissociada o balão usando um microscópio de contraste de luz/fase (com uma lente de objetiva X 10 ). Adicionar 4 mL de meio de cultura para neutralizar a reação tripsinização. Transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrífuga no x 200 g de 4 min para as células de Pelotas. Lentamente, Aspire o sobrenadante, tomando cuidado para não deslocar o pellet. Ressuspender o pellet em 5 mL de meio. Transferir uma alíquota de 20 µ l de suspensão de célula para um hemocytometer limpo e contar as células usando um microscópio equipado com uma lente de objetiva 10 X. Preparar células para a explosão, colocando três pratos de 35 milímetros dentro de um prato de 90 mm. Rotulá-los adequadamente. Adicionar 2 mL do meio de cada prato de 35mm e um total de 5 x 10 4 células por prato, distribuir as células uniformemente ao redor do prato de sementes. Incubar as amostras experimentais durante a noite, em condições de cultura padrão para permitir a penhora de célula adequada antes da onda de choque exposição. Nota: Para a imagem latente fluorescente, células devem ser propagadas para as lamelas de vidro estéril. 2. Conjunto de tubo de choque Figura 2 : EVOC Rig e choque tubo Assembly. Imagem do (A) da plataforma EVOC. (B) esquema de aparelho de tubo de choque. Dimensões do tubo de choque incluem um diâmetro interno de 59 mm e um comprimento total, incluindo o equipamento EVOC, de 4,13 m. O comprimento do tubo conduzido e os totais de equipamento EVOC 2,71 m. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Usar botas biqueira de aço e um casaco de laboratório durante os procedimentos de montagem. Inserir as barras de dois alinhamento através dos furos de dois parafuso encontraram no plano horizontal da flange de saída. Coloque uma folha de gaxeta de borracha nitrílica sobre a extremidade das barras de alinhamento para que senta-se entre o flange de saída e o equipamento de cultura (EVOC) ex vivo órgão. Nota: O equipamento de EVOC é um dispositivo elétrico projetados para uso com pratos de Petri 35mm ( Figura 2A). Coloque o equipamento EVOC para o flange de saída do tubo de choque deslizando o dispositivo elétrico sobre as barras de alinhamento, garantindo que é orientado corretamente para que a seção que contém a placa de Petri está localizada em sua base. Introduzir quatro M24 parafusos e anilhas nos furos restantes. Coloque as porcas para que eles toquem a flange. Firmemente apertar as porcas e parafusos sequencialmente de forma simétrica na diagonal enquanto visualmente verificar que o tubo de equipamento e choque EVOC ter alinhado com sucesso. Anexar um transdutor de pressão para o equipamento de EVOC e conectá-lo à fonte de corrente usando um cabo do sensor. Então, usando um cabo BNC, ligue a fonte de corrente para osciloscópio. , Certifique-se de que todos solte válvulas e fluem de controles sobre o tubo de choque está fechadas. Abra a linha interna externa de ar comprimido e manualmente rode o regulador de pressão para carregar o solenoide para 2,5 bar Abra a válvula da garrafa de gás comprimido, girando-a no sentido anti-horário 180°. Lentamente gire o regulador de pressão, localizado na parte superior da garrafa de gás, no sentido horário para aumentar a pressão para aproximadamente 15 bar Nota: O ponto de ajuste deste regulador deve ser ligeiramente acima do mais alto estourando a pressão do diafragma mais grosso que deve ser usada no experimento. Preparar os diafragmas por uma folha de plástico de 0,125 mm de espessura de corte em quadrados de 10 x 10 cm. Nota: A espessura do diafragma será correlacionar com a pressão de rotura, alterando a pressão de pico da onda de choque (ou seja, um diafragma mais grosso irá resultar em uma onda de choque com uma maior pressão de pico; A tabela 1). < tabela fo:keep-together.within-página = "1" > diafragma de Mylar dimensões (cm) pressão (bar) de ruptura Sensor 3 faixa de pressão (kPa) 10 x 10 x 0,023 2 ± 0,2 ± 47 7.5 10 x 10 x 0.050 4 ± 0,2 ± 72 7,5 10 x 10 x 0,125 9,5 ± 0,5 ± 127 12.5 tabela 1: Burst pressão correspondente à espessura do diafragma e pressão de pico. criar identificadores sem fita, corrigi-los para a parte superior e inferior do diafragma e usá-los cuidadosamente, posicionar o diafragma ao lado do flange dianteira pequena pela câmara de culatra. Certifique-se de que o diafragma é reta e corretamente posicionado antes de fechar a culatra. Este seguro usando quatro M24 parafusos e porcas. Firmemente, aperte as porcas e parafusos em sequência de forma simétrica na diagonal. 3. Preparação de células apenas antes da onda de choque exposição Prepare um capuz de fluxo laminar de tecido através da realização de esterilização ultravioleta. Limpá-lo com um desinfetante solução e 70% de etanol. Recolher todos os itens necessários para a manipulação de células prévia para/post-choc exposição de onda e colocá-los dentro do capô estéril. Nota: Isto inclui meio fresco, adesivas membranas permeável ao gás, tesoura estéril, pipeta e pipeta dicas. Transferir um prato de Petri de 90 milímetros contendo três amostras experimentais de incubadora para o capô estéril. Corte uma membrana permeável ao gás adesiva da folha (ver a Tabela de materiais) em seis quadrados, tal que cada um é grande o suficiente para cobrir o topo de um prato de Petri de 35 mm. Aspire o médio de 35 milímetros de Petri, coloque a tampa de um lado e cubra com duas seções de adesivo membranas permeável ao gás, garantindo que não há um selo apertado entre a membrana e a borda do prato. Transferir a amostra para o equipamento de EVOC e fixá-lo na base de fixação do modo que a parte superior do prato está alinhada com a base interna do tubo de choque. 4. Operação do tubo de choque usar protectores auriculares, óculos de proteção de olho, botas de segurança e um casaco de laboratório ao pressurizar o sistema de tubo de choque. Rode o botão de controle de fluxo da válvula, permitindo que o gás flua a mangueira flexível conectando o cilindro de ar comprimido para o tubo de choque. Na parte inferior do painel de controle, selecione o " duplo culatra " entrada para um wav de choque de curta duraçãoe ou o " tubo condutor " entrada para uma duração maior onda. Ligue a fonte de alimentação CC e osciloscópio para adquirir os dados de forma de onda de . Definir a taxa de amostragem osciloscópio de 50,0 MS/s, com um comprimento de 1 M do registro pontos. Definir um intervalo de 50 mV para disparar no bar 2 e 100 mV para acima de 4 bar Ligar as luzes de segurança utilizando o interruptor na parede em frente ao painel de controle. Nota: Este diz que outros pesquisadores não para entrar na sala quando o tubo de choque está cobrando. Ligue o interruptor da caixa de controle do solenoide para fechar o solenoide. Nota: Esse recurso de segurança fecha uma válvula situada na câmara de culatra dupla, permitindo o sistema a ser carregado. No painel de controle, abra lentamente o controle de fluxo girando o botão no sentido anti-horário para aumentar gradualmente a pressão dentro da câmara de compressão. Monitorar a pressão usando o visor do painel de controle. , Uma vez que a pressão de ruptura do diafragma é alcançado, o diafragma se romper e um " bang " será ouvido. Fechar rapidamente o controle de fluxo girando o botão. Nota: A onda de choque vai viajar para baixo o tubo da amostra de célula e a extremidade do tubo. Abrir o solenoide, desligando o interruptor na caixa de controle do solenoide e desligar a luz de segurança (utilizando o interruptor na parede em frente ao painel de controle). Transferir a amostra de células para o hood estéril, remova as adesivas membranas permeável ao gás e encher o prato com 2 mL de meio de cultura fresco. As células podem ser usadas imediatamente para avaliação, conforme descrito na etapa 5, ou voltou para a incubadora para estudos de longo prazo. 5. Viabilidade celular avaliar viabilidade de celular após a exposição de ondas de choque, usando a combinação de um ensaio de indicador redox e a imagem fluorescente de células vivas e mortas. Nota: Para a imagem latente fluorescente, células devem ser propagadas para as lamelas de vidro estéril durante a seção 1: preparação de cultura e amostra de células. Estes podem ser colocados dentro os pratos de petri 35mm. Transferência de 200 µ l de reagente indicador redox (consulte a Tabela de materiais) para cada prato experimental diretamente depois da recarga-los com 2 mL de pós-choque médio onda exposição. Incubar a condições de cultura padrão para 4 h. Para cada prato, transferir (em uma capa escura de estéril) alíquotas de 2 x 100 µ l para um preto ou limpar a placa de 96 poços, dependendo se fluorescência ou absorvância será usada para avaliar a viabilidade. Transferir a placa de 96 poços para um leitor adequado equipado com os filtros corretos e ler usando a excitação bandas 530ex/590em de fluorescência ou 570 nm combinado com uma referência de 600 nm para absorvância. Exportar e salvar os dados. Analisar os dados para identificar qualquer diferença entre a onda de choque-expostos amostras e controles não-expostos, como isso pode indicar uma queda na viabilidade celular. Nota: Um controle negativo também deve ser incluído no projeto experimental. Além disso, a interpolação de uma curva padrão pode ser usada para calcular números de celular. , Aspire o meio contendo o reagente de indicador redox. Substituí-lo com 2 mL de meio fresco e incube as celulas em condições de cultura padrão para 24 h. Repita os passos acima, se necessário para obter um segundo ponto de tempo de viabilidade. Para a imagem fluorescente de células vivas e mortas, Aspire o meio e lavar as células duas vezes em 1 mL de PBS. Transferir 100 µ l de reagente completo encontrado na imagem kit (veja a Tabela de materiais) para cada amostra e incubar a temperatura ambiente protegida da luz por 15 min. Reagente de aspirar e lavar uma vez usando 1 mL de PBS. Usando pinças de ponta fina, cuidadosamente remova o prato de 35mm a lamela e colocá-lo virado para baixo sobre uma lâmina de vidro de microscopia. Adquirir imagens para cada amostra, usando um microscópio fluorescente (10 X da lente objetiva, abertura numérica 0.50) equipados com os filtros de excitação e emissão corretos (ex / em 488 nm/515 nm e 570 nm nm/602). Nota: Células vivas irão emitir fluorescência intensa, uniforme, verde. Mortos ou moribundos células com uma membrana celular comprometida serão absorção do componente kit morto, resultando em emissão de fluorescência vermelha, encontrados predominantemente na região nuclear da célula. Usar a análise de imagem, software para também manualmente ou automaticamente contar o número de células vivas e mortas de cada imagem.

Representative Results

Crescido em uma monocamada de células usando o método acima descrito, foram expostas em triplicado para as ondas de choque geradas usando um tubo de choque (Figura 2B). Marcadores de viabilidade celular foram avaliados. Usando um ensaio de indicador redox, verificou que a aplicação de uma onda de choque de 127 kPa foi capaz de reduzir significativamente a viabilidade das células de papila dérmica em comparação aos controles após 24h em cultura (Figura 3). A aplicação de uma onda de choque ≤72 kPa não reduz a viabilidade. Para apoiar estas observações, utilizou-se um ensaio de imagem fluorescente capaz de fluorescente rotulagem células ao vivo ou mortas com fluorophores verde ou vermelha, respectivamente. A quantificação de células vivas e mortas de 13 imagens fluorescentes por replicar biológica demonstrou uma redução na viabilidade celular em pessoas expostas à onda de choque de 127 kPa quando comparado ao controle (Figura 4). Análise estatística foi realizada utilizando uma One-Way ANOVA, seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey, com p < 0,05 considerado estatisticamente significativo. O tamanho da amostra por grupo totalizou 9 para o ensaio de indicador redox e 39 para a análise de imagens de fluorescência quantitativa. Figura 3 : Dados de ensaio de indicador redox mostrando tempo curso de viabilidade celular após a exposição de ondas de choque. Significativamente menos células foram observadas após 24 h do grupo de ondas de choque-expostos 127-kPa quando comparado com o controle não tratado. O controle negativo que consistia de um tratamento de 30-s com 2% desinfetante (consulte a tabela de materiais) mostrou significativamente menos células no T0 e 24 h, em comparação com todos os outros grupos. Cada barra representa o média ± 1 desvio-padrão (SD); réplicas biológicas, N = 3; técnico Replica, n = 3. = p < 0,0001. * = p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4 : Fluorescência Imaging. (A) dados quantitativos recolhidos do fluorescentes imagens de células vivas e mortas capturadas usando um microscópio de fluorescência na exposição de ondas de pós-choque 24 h. Significativamente menos células viáveis foram observadas em kPa a 127 (quer dizer = 93.42) amostra exposta por ondas de choque em comparação com o 47 kPa (quer dizer = 98.18), 72 kPa (quer dizer = 98.87) e grupos de controle (quer dizer = 99.10). Não há células viáveis foram observadas no grupo controle negativo após 24h (quer dizer = 0). (B) imagens de fluorescência representativa. Verde mostra células vivas, enquanto o vermelho mostra as células mortas. Cada parcela de caixa mostra os quartis superiores e inferiores com bigodes de Tukey; réplicas biológicas, N = 3; técnico Replica, n = 13. = p < 0,0001. Barra de escala = 300 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Lesões primárias obtidas da exposição a eventos de explosão ainda não são totalmente compreendidos. Identificar e compreender os mecanismos que provocam lesões induzida pela explosão, como da lesão cerebral traumática³^,⁴ e ossificação heterotópica⁶^,⁷, são importantes primeiros passos para o desenvolvimento métodos eficazes de profilaxia. Para ajudar a alcançar este objetivo, um número de sistemas experimentais foram desenvolvido para replicar a explosão evento exposição¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁸^,¹⁹. A técnica descrita aqui usa tubo equipamento de choque (Figura 2) capaz de disparar ondas de choque em uma gama de pressões em todo o corpo (ou seja, roedores), amostras de células ou tecidos. A capacidade de carregar tipos de células individuais em vez de tecidos dá a capacidade de analisar respostas celulares distintas, como dano pode ocorrer simultaneamente através de uma variedade de mecanismos¹^,². Por exemplo, para modelar traumático lesão cerebral, a avaliação dos tipos de células individuais, tais como os neurônios e astrócitos, pode permitir a identificação de lesões de células específicas. Além disso, a resposta de todo órgão pode ser avaliada usando o tecido cerebral. Ambos os tipos de célula individual e as amostras de tecido tem valor e podem dar informações diferentes. Também é possível alterar a quantidade de ar que é pressurizado para gerar o choque, selecionando a entrada dupla-culatra ou condutor-tubo. Este controla a duração da onda de choque. Outra possibilidade é mudar o diafragma material e espessura para alterar a pressão de pico²⁵.

Outro fator a considerar são efeitos de fim de interferências que podem estar presentes quando o compartimento de amostra está localizado perto da saída do tubo de choque, como a encontrada na plataforma EVOC descrita no actual sistema. Cavalcanti et al . olhou para explosão onda perfis encontrados em locais diferentes em um tubo de choque controlado por compressão e encontrado que a forma de onda Friedlander foi melhor representada em um local dentro do tubo de choque¹⁵. Kuriakose et al também estudou o secundário carregamento da amostra e descobriu que a colocação de uma placa final no final do tubo de choque era capaz de eliminar ondas refletidas indesejados¹⁶. Considerando os dados encontrados nestas publicações¹⁵^,¹⁶, futuras modificações para melhorar o sistema de tubo de choque descrito neste artigo poderiam envolver a colocação do equipamento em um local mais profundo dentro do tubo conduzido EVOC ou, Alternativamente, a inclusão de uma placa final do tubo de choque. Limitações do método descrito poderiam incluir a taxa de transferência relativamente baixa das amostras. Um único usuário pode operar o tubo de choque com segurança em uma saída de em torno de 6-8 amostras por hora. Actualmente, o sistema é projetado em torno do uso de pratos de petri 35mm único. Portanto, maiores experimentos contendo vários grupos e repetições biológicas podem ser difícil de alcançar.

Este artigo de métodos mostra como a viabilidade das células da papila dérmica aderentes foi afetada pela exposição a uma única onda de choque. Uma onda de choque de curta duração (< 10 ms) de ≤72 kPa não afetou viabilidade quando comparado ao controle (Figura 3 e Figura 4). Em contraste, uma onda de choque no 127 kPa estimulou uma queda significativa na viabilidade no pós explosão 24h, como mostrado por um ensaio de indicador redox (Figura 3) e análise de imagens fluorescentes (Figura 4). Miller et al relataram uma redução similar na viabilidade celular em culturas de fatias hippocampal do rato organotypic quando as células foram expostas a um qualquer um 147 kPa ou onda de choque de 278 kPa usando um tubo de choque em aberto, orientado por Hélio¹⁴. Em contraste, VandeVord et al . reportou que não havia nenhum efeito sobre a viabilidade em astrócitos de ratos expostos a uma sobrepressão de curta duração de > 200 kPa, embora um barochamber foi usado em vez de um tubo de choque¹⁸. Deve notar-se que a pressão externa é dependente da onda de explosão, embora isto cria ondas de estresse complexo dentro do corpo, portanto, tornando a natureza do carregamento altamente depende das propriedades mecânicas do tecido ou da célula. Estudos de caracterização adicional da resposta celular aos eventos de explosão é necessária. Além disso, avaliando exposição de onda de choque a nível celular, como mostrado nesta técnica, respostas biológicas acionadas por lesão, tais como a perturbação de sinalização de percursos ou alterações epigenéticas, podem ser identificadas e exploradas ainda mais.

Em conclusão, este trabalho descreve o uso de um tubo de aço inoxidável de choque e um aparelho EVOC modificado para incorporar culturas celulares primárias. Ondas de choque em uma gama de pressões podem ser geradas e propagadas em células vivas para replicar os efeitos que ocorrem pela exposição a uma onda de choque. Este protocolo demonstra como avaliar a viabilidade celular, mas a longo prazo alterações em tipos de células individuais também podem ser estudadas. Vai em frente, pretendemos avaliar os efeitos diferenciais que complexas ondas de choque pode eliciar em diferentes tipos de células, com o objectivo de aprofundar a nossa compreensão das lesões primárias induzida pela explosão.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nós gostaríamos de reconhecer o apoio financeiro do centro da Legião real britânica para estudos de lesão explosão HA e financiamento do Conselho de pesquisa médica (M01858X/1) para CAH.

Materials

MEM α, nucleosides	ThermoFisher	22571020
Fetal Bovine Serum, certified, US origin	ThermoFisher	16000044	Supplement to create complete growth media.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15070-063	Supplement to create complete growth media.
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	ThermoFisher	15400-054	Dilute 1 in 10 before use.
CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented	Starlab	CC7682-4875
TC Dish (PS) 35mm, 8.5 cm2	Triple Red	TCD010035
Petri dish (PS) 90×14.2mm no vent	VWR UK	391-0453
Gas Permeable Adhesive Plate Seals	ThermoFisher	AB-0718
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	ThermoFisher	R37601
Alamarblue cell viability reagent	Fisher Scientific	13494309
Virkon tablets	VWR UK	115-0020	Use to create 2% solution as viability control reagent.
Dumont forceps	SurgicalTools	11295-10	Use to remove coverslips from petri dish.
Cover glass, square	VWR UK	631-0125
Microscope slides	VWR UK	631-1553
96 Well plate, solid black	AppletonWoods	CC760	Plate to be used for fluorescence measurements.
96 Well plate, clear, (PS)	VWR UK	734-1799	Plate to be used for absorbance measurments.
Leica DMi1 Camera stand outfit	Leica Microsystems		Optical microscope used for cell culture.
Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton	Zeiss		Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging.
EnVision Multilabel Reader	PerkinElmer	2104-0010A	Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings.
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.023mm	RS Components	785-0782	Use to create shock tube diaphragm.
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.05mm	RS Components	785-0786	Use to creatw shock tube diaphragm.
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.125mm	RS Components	785-0798	Use to create shock tube diaphragm.
Current source power unit	Dytran Intruments Inc.	4103C	Power source for 2300V1 sensor.
IEPE Pressure Sensor	Dytran Intruments Inc.	2300V1	Pressure sensor located on shock tube.
Digital Phosphor Oscilloscope	Tektronix	DPO 4104B	Use to gather and save sensor 2300V1 data.

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Logan, N. J., Arora, H., Higgins, C. A. Evaluating Primary Blast Effects In Vitro. J. Vis. Exp. (127), e55618, doi:10.3791/55618 (2017).

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