Evaluación primaria explosión efectos In Vitro

1. cultivo de células y preparación de la muestra obtener una línea celular apropiado (p. ej., las células de la papila dérmica). Nota: El protocolo actual ha sido diseñado para las células adherentes, con fibroblastos de la papila dérmica de rata aislados de vibrissae utilizado como modelo. De la cultura las células en un frasco de T-75 que contenga mínimo esencial α de (MEM) medio suplementado con 10% suero bovino fetal y 1% penicilina estreptomicina. Mantener las células en condiciones de cultivo estándar de 37 ° C y 5% de CO 2 en un ambiente humidificado hasta llegar a confluencia del 80%. Aspire el medio y se lavan las células dos veces en Dulbecco ' solución salina s tampón fosfato (PBS). Disociar las células del frasco por incubación en 2 mL de tripsina/EDTA estándar cultura condiciones para 5 minutos comprobar brevemente para asegurar que las células han disociado con éxito del frasco usando un microscopio de contraste de fase/luz (con un objetivo de 10 X ). Añadir 4 mL de medio de cultivo para neutralizar la reacción de la tripsinización. Transferir la suspensión de células a un tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a 200 x g durante 4 minutos para que sedimenten las células. Lentamente, aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no para desalojar la pelotilla. Resuspenda el sedimento en 5 mL de medio. Transferir una alícuota de 20 μl de la suspensión de células en un hemocitómetro limpio y contar las células utilizando un microscopio con un objetivo de 10 X. Preparar las células para la explosión mediante la colocación de tres platos de 35 mm dentro de un plato de 90 mm. Etiquetarlos adecuadamente. Añadir 2 mL del medio de cada plato de 35 mm y un total de 5 x 10 4 células por plato, distribuir las células uniformemente alrededor de la fuente de la semilla. Incubar las muestras experimentales durante la noche en condiciones de cultivo estándar para permitir el accesorio de celular adecuada antes de la exposición de ondas de choque. Nota: Imagen fluorescente, las células deben ser sembradas sobre cubreobjetos de vidrio estéril. 2. Conjunto de tubo de choque figura 2 : EVOC la plataforma y descarga tubo conjunto. (A) imagen de la plataforma EVOC. (B) esquema de los aparatos de tubo de choque. Dimensiones de tubo de choque incluyen 59 mm y una longitud total, incluyendo la plataforma EVOC, 4,13 m de diámetro interior. La longitud del tubo conducido y los totales de la plataforma EVOC 2,71 m. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Usar botas de trabajo punta de acero y una capa de laboratorio durante los procedimientos de montaje. Insertar las barras de alineación de dos a través de los agujeros de dos perno encontraron en el plano horizontal de la brida de salida. Coloque una hoja de la Junta de caucho de nitrilo sobre el extremo de las barras de alineación para que se sienta entre el reborde del enchufe y el aparejo vivo ex órgano cultura (EVOC). Nota: La plataforma de EVOC es un accesorio diseñado para uso con platos de Petri de 35 mm ( figura 2A). Fijar el aparejo EVOC a la brida de salida del tubo de descarga deslizando el accesorio sobre las barras de alineación, asegurándose que esté orientado correctamente para que la sección que contiene la caja Petri se encuentra en su base. Introduzca cuatro tornillos M24 y arandelas en los orificios restantes. Coloque las tuercas de manera que toquen la brida. Firmemente apriete las tuercas y los pernos secuencialmente de manera diagonal simétrica mientras que controlar visualmente que el tubo de la plataforma y el choque EVOC han alineado con éxito. Colocar un transductor de presión para la plataforma EVOC y conectarlo a la fuente de corriente mediante un cable sensor. Luego, usando un cable BNC, conecte la fuente de corriente para el osciloscopio. Asegúrese de que todos liberan válvulas y controles en el tubo de descarga de flujo está cerrados. Abra la línea de aire comprimido incorporado y manualmente gire el regulador de presión para cargar el solenoide a 2,5 bar Abrir la válvula de seguridad de la botella de gas comprimido en el 180° en sentido antihorario. Gire lentamente el regulador de presión, situado en la cima de la botella de gas, hacia la derecha para aumentar la presión a aproximadamente 15 bar Nota: El punto de ajuste de este regulador debe estar ligeramente por encima de la más alta presión de ruptura del diafragma más grueso que debe ser utilizado en el experimento de. Preparar los diafragmas por una lámina de plástico 0.125 mm de espesor de corte en cuadrados de 10 cm x 10 cm. Nota: El espesor del diafragma se correlaciona con las presiones de trabajo, alteración de la presión pico de la onda de choque (es decir, un diafragma más grueso se traducirá en una onda de choque con una presión máxima más grande; Tabla 1). < mesa fo:keep-together.within-página = "1" > diafragma de Mylar dimensiones (cm) presión (bar) de la explosión 3 Sensor de rango de presión (kPa) x 10 x 10 0.023 2 ± 0.2 47 ± 7.5 10 x 10 x 0.050 4 ± 0.2 72 ± 7.5 10 x 10 x 0.125 ± 9,5 0,5 127 ± 12.5 tabla 1: explosión presión correspondiente al espesor de la membrana y la presión máxima. crear asas de cinta, fijan los mismos a la parte superior e inferior del diafragma y utilizarlos cuidadosamente colocar el diafragma junto a la brida pequeña delantera por la sala de la recámara. Asegúrese de que el diafragma esté recta y correctamente posicionados antes de cerrar la recámara. Esto asegure usando cuatro pernos M24 y tuercas. Apriete firmemente las tuercas y los pernos secuencialmente de manera diagonal simétrica. 3. Preparación de las células justo antes de la exposición de ondas de choque preparar una campana de flujo laminar de tejido al realizar la esterilización ultravioleta. Limpie con un desinfectante solución y 70% de etanol. Reunir todos los elementos necesarios para la manipulación de células previa a/post-choque de onda exposición y colocan dentro de la campana estéril. Nota: Esto incluye el medio fresco, membranas permeables al gas adhesivo, tijeras estériles, pipetas y pipeta consejos. Transferencia de un plato de Petri de 90 mm que contienen tres muestras experimentales de la incubadora a la campana estéril. Corte de una membrana permeable al gas adhesivo de la hoja (véase la Tabla de materiales) en seis cuadrados, tales que cada uno es lo suficientemente grande como para cubrir la parte superior de un plato de Petri de 35 mm. Aspirar el medio de la placa de Petri de 35 mm, coloque la tapa a un lado y cubierta con dos tramos de adhesivo membranas permeables al gas, que haya un sello hermético entre la membrana y el borde del plato. Transferir la muestra a la plataforma EVOC y fijarlo a la base de la lámpara para que la parte superior del plato se alinea con la base interna del tubo de descarga. 4. Operación del tubo de choque usar orejeras, anteojos, botas de seguridad y una capa del laboratorio al presurizar el sistema de tubo de descarga. Gire la perilla de control de flujo en el regulador, permitiendo fluir en el tubo flexible, conectar el cilindro de aire comprimido al tubo de descarga de gas. En la parte inferior del panel de control, seleccionar la " podálica doble " entrada para un wav de choque de corta duracióne o la " tubo conductor " entrada para una duración de onda mayor. Encender la fuente de alimentación CC y osciloscopio para adquirir los datos de forma de onda. Ajustar el osciloscopio de muestreo a 50,0 m/s, con una longitud de registro de 1 M puntos. Establecer un rango de 50 mV para disparar a 2 bar y 100 mV por encima de 4 bar Encender las luces de seguridad usando el interruptor en la pared opuesta del panel de control. Nota: Esto le dice a otros investigadores no para entrar en la habitación cuando se está cargando el tubo de descarga. Gire el interruptor en la caja de control de solenoide para cerrar el solenoide. Nota: Esta función de seguridad cierra una válvula situada en el compartimiento trasero doble, permitiendo que el sistema cargará. En el panel de control, abra lentamente el control del flujo girando la perilla en sentido antihorario para aumentar gradualmente la presión dentro de la cámara de compresión. Medir la presión usando la pantalla del panel de control. Se llega a una vez que la presión de ruptura de la membrana, la membrana se rompa y un " bang " se escuchará. Cerrar rápidamente el control del flujo girando la perilla de. Nota: La onda de choque viajará por el tubo sobre la muestra de la célula y hacia fuera el extremo del tubo. Abrir el solenoide girando el interruptor en la caja de control de solenoide y apagar la luz de seguridad (usando el interruptor en la pared opuesta del panel de control). Transferir la muestra de células para la campana estéril, retirar el adhesivo membranas permeables al gas y llenar el plato con 2 mL de medio de cultivo fresco. Las células pueden ser utilizadas inmediatamente para la evaluación, como se describe en el paso 5, o devuelta a la incubadora para estudios a largo plazo. 5. Viabilidad celular evaluar viabilidad de las células después de la exposición de ondas de choque mediante la combinación de un análisis de indicador redox y la proyección de imagen fluorescente de células vivas y muertas. Nota: Imagen fluorescente, las células deben ser sembradas sobre cubreobjetos de vidrio estéril durante la sección 1: cultura y muestra la preparación de la célula. Estos pueden colocarse dentro de los platos de petri de 35 mm. Transferencia de 200 μL del reactivo indicador redox (véase la Tabla de materiales) a cada plato experimental directamente después de rellenar con 2 mL de medio choque posterior onda de exposición. Incubar en las condiciones de cultivo estándar para 4 h. Para cada plato, transvasar (en una campana estéril oscurezca) 2 x 100 μl a cada negro o claro placa de 96 pocillos, dependiendo de si la fluorescencia o la absorbancia se utiliza para evaluar viabilidad. Transferir la placa de 96 pocillos en un lector apropiado con los filtros correctos y leer utilizando bandas de excitación 530ex/590em por fluorescencia o 570 nm combinado con una referencia de 600 nm de absorbancia. Exportar y guardar los datos. Analizar los datos para identificar cualquier diferencia entre las muestras expuestas a ondas de choque y controles no expuestos, como esto puede indicar una disminución en la viabilidad celular. Nota: Un control negativo debe incluirse también en el diseño experimental. Además, la interpolación de una curva estándar se puede usar para calcular el número de células. Aspire el medio que contiene el reactivo indicador de redox. Reemplazar con 2 mL de medio fresco e incubar las células en condiciones de cultivo estándar para 24 h. Repetir los pasos anteriores según sea necesario para obtener un segundo momento de viabilidad. Para la proyección de imagen fluorescente de células vivas y muertas, Aspire el medio y lavan las células dos veces en 1 mL de PBS. Transferir 100 μl del reactivo completo encontrado en la proyección de imagen kit (véase la Tabla de materiales) para cada muestra e incubar a temperatura ambiente protegido de la luz por 15 minutos Aspirar el reactivo y lavar una vez con 1 mL de PBS. Cuidadosamente con unas pinzas de punta fina, quitar el cubreobjetos de la fuente de 35 mm y colocarlo boca abajo sobre un portaobjeto de microscopio. Adquisición de imágenes para cada muestra usando un microscopio de fluorescencia (objetivo de 10 X, abertura numérica 0.50) equipado con los filtros de excitación y emisión correcta (ex / em 488 nm/515 nm y 570 nm nm/602). Nota: Células vivas emite fluorescencia verde, intenso y uniforme. Las células muertas o moribundas con una membrana celular comprometida serán la absorción el componente muerto, dando por resultado la emisión de fluorescencia roja, encontró predominante en la región nuclear de la célula. Análisis de la imagen software ya sea manualmente o automáticamente, cuente el número de células vivas y muertas de cada imagen.