Evaluating Primary Blast Effects <em>In Vitro</em>

Niall J. Logan; Hari Arora; Claire A. Higgins

doi:10.3791/55618

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioengineering

تقييم الابتدائي الانفجار آثار في المختبر

Published: September 18, 2017

doi:

10.3791/55618

Niall J. Logan¹, Hari Arora¹, Claire A. Higgins¹

¹Department of Bioengineering,Imperial College London

Summary

فهم كيف يتم الخلايا عن طريق التعرض لموجات الصدمة التضمين يمكن أن تساعد في تحديد الآليات وراء الإصابات الناجمة عن أحداث الانفجار. هذا البروتوكول يستخدم معدات أنبوب الصدمة مبنية خصيصا لتطبيق موجات الصدمة في طائفة من الضغوط على مونولاييرس الخلية وتحديد الآثار اللاحقة على بقاء الخلية.

Abstract

يمكن أن يسبب التعرض لإحداث الانفجار صدمة شديدة للأجهزة الحيوية في الجسم مثل الرئتين وأذنيه، والدماغ. فهم الآليات وراء هذه الإصابات الناجمة عن الانفجار أهمية كبرى بالنظر في الاتجاه الأخير نحو استخدام المتفجرات في الحروب الحديثة، والحوادث المتصلة بالإرهاب. لنفهم تماما الضرر الناجم عن الانفجار، يجب أولاً قادرة على تكرار مثل هذه الأحداث الانفجار في بيئة تسيطر عليها باستخدام أسلوب استنساخه. في هذا الأسلوب باستخدام معدات أنبوب الصدمة، يمكن نشر موجات الصدمة في طائفة من الضغوط على الخلايا الحية التي نمت في 2D، ويمكن تحليل البصمات لبقاء الخلية فورا استخدام مقايسة مؤشر الأكسدة والتصوير الفلورسنت من الخلايا الحية والميتة. هذا الأسلوب أثبت أن زيادة يركب انفجار ذروة للجيش الشعبي الكوري 127 يمكن أن تحفز انخفاضا كبيرا في بقاء الخلية عند مقارنتها بعناصر التحكم غير المعالجة. لا تقتصر على خلايا ملتصقة عينات الاختبار، ولكن يمكن أن تشمل تعليق خلية، عينات كامل الجسم والأنسجة، من خلال إجراء تعديلات طفيفة على الإعداد أنبوب الصدمة. من الصعب تكرار الظروف الدقيقة التي تواجه الأنسجة والخلايا عند تعرضها لحادث انفجار حقيقي. يمكن أن تساعد تقنيات مثل تلك المعروضة في هذه المقالة لتحديد عتبات الضرر وتحديد التغييرات النسخي وجينيه داخل الخلايا التي تنشأ من التعرض لموجة الصدمة.

Introduction

مع الاتجاه الأخير نحو استخدام الأجهزة المتفجرة المرتجلة في الحروب الحديثة والأعمال الإرهابية ضد المدنيين، فهم آثار الأحداث المتفجرة في جسم الإنسان ذات أهمية كبيرة. يمكن أن تكون الإصابات التي تم الحصول عليها من خلال التعرض لإحداث انفجار القاتلة والفتاكة، مع العمليات الفيزيائية للإصابة ويجري تقسيمها إلى أربع فئات. نتيجة الإصابات الأولية من التعرض المباشر لموجة الانفجار، الذي يتفاعل مع الجسم محلياً بطريقة ضاغطة وتوسعية في وقت لاحق، مما تسبب في تمزق الأغشية والأنسجة الرخوة¹. وتشمل الإصابات الثانوية صدمة حادة أو مخترق الجروح الناجمة عن تأثير مع الأجسام منخفضة الكتلة تدفعها موجه الانفجار في السرعات العالية. تحدث إصابات العالي عند موجه الانفجار لديه طاقة كافية لرمي الأجسام كتلة عالية أو الأفراد ضد الكائنات. وأخيراً، تعرف الإصابات الناجمة عن انفجار رباعي الإصابات الأخرى المتنوعة التي لا تتناسب مع الفئات الأخرى، مثل الحروق فلاش². وبعد التعرض لمثل هذه الأحداث الانفجار، تشمل الإصابات الأولية الدماغ إصابة³^،^،من⁴⁵،⁶^،هيتيروتوبيك التحجر⁷، انفجار الرئة الإصابة⁸، فقدان السمع ⁹، والبعض الآخر¹⁰.

هو الموجي الملاحظ عموما من أحداث انفجار موجه فريدلاندر، تمثل انفجار مجاناً-ميدان، مقابل مساحة المغلقة،. ويتكون الموجي جبهة الانفجار التي يمكن تعريفها بأنها ارتفاع حاد وسريع في الضغط الإيجابي. هذا هو متبوعة مباشرة بانفجار رياح من الهواء تتحرك في سرعة عالية وموجه إصدار الذي يقلل من الضغط لأسفل مستويات الغلاف الجوي. يتم ترك فراغ جزئي في منطقة الانفجار الأولى، الذي ينتج في الدفق بطيء للهواء. المراحل الإيجابية والسلبية للموجة (الشكل 1A) تؤدي حركة دفع وجذب انفجار الموجه¹. للمساعدة في توضيح الآليات وراء الإصابات الناجمة عن انفجار الأولية، تم إنشاء نماذج تجريبية لإنتاج الطول الموجي، مثل موجه فريدلاندر، التي سوف تواجه الخلايا والأنسجة عند التعرض لحادث انفجار حقيقي. وتشمل النظم الحالية المدرجة في الأدب صدمة أنابيب¹¹^،¹²^،¹³^،¹⁴^،¹⁵^،^،من¹⁶¹⁷، باروتشامبيرس¹⁸^،¹⁹و بار كولسكي²⁰و المحاكاة المتقدمة انفجار²¹، شريط ضغط “هوبكنسون تقسيم”²²والترفيه لإحداث الانفجار بديلة في بيئة تسيطر عليها باستخدام ثريتول تترانيترات²³. على الرغم من مجموعة واسعة من النماذج المتاحة، العديد من المتغيرات تؤثر الإصابة التي تم الحصول عليها من موجات الانفجار، بما في ذلك الضغط قبل تطبيقها، وخصائص الميكانيكية، أنواع الخلايا الفردية أو الأنسجة تحت التقييم²⁴. بينما دراسة أنسجة أو أجهزة يمكن تسليط الضوء على تشوه النسيج وإجمالي التغييرات الشكلية التي تكبدتها نتيجة لإحداث الانفجار، يمكن كشف التحليل على المستوى الخلوي تغييرات جينية والنسخي تتأثر بموجة الصدمة.

توضح هذه المقالة أساليب تقنية لنشر موجات الصدمة في طائفة من الضغوط على الخلايا الحية في أحادي الطبقة. وهذا يسمح لتوصيف الفوري لبقاء الخلية، توضيح عتبات الأضرار المحتملة من موجات الصدمة. وعلاوة على ذلك، يمكن إرجاع خلايا قابلة للتطبيق لشروط الثقافة القياسية، ويمكن تقييم الآثار البيولوجية الطويلة الأجل من حدث الانفجار. البروتوكول أدناه توضح هذه المقالة اثنين من التقنيات بقاء الخلية التي يمكن استخدامها في الخلايا في الثقافة.

رقم 1: تقدير تقريبي لموجة فريدلاندر. (أ) تقريبي لموجة فريدلاندر لاحظ في استشعار 3 على أنبوب الصدمة. (ب) بيانات تمثيلية تبين الملامح ضغط مختلفة في أجهزة الاستشعار 1 و 2 و 3 على أنبوب الصدمة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Protocol

1-ثقافة الخلية وإعداد نموذج الحصول على خط خلية مناسبة (مثلاً، خلايا الجلد الحليمة). ملاحظة: قد صمم البروتوكول الحالي للخلايا ملتصقة، مع الفئران الحليمة جلدي الليفية معزولة عن بيبرس المستخدمة كنموذج- الثقافة الخلايا في قارورة T-75 التي تحتوي على الحد الأدنى الضروري متوسطة (MEM) α تستكمل مع المصل البقري الجنين 10% و 1% البنسلين والستربتوميسين. إبقاء الخلايا في ظروف الثقافة القياسية من 37 درجة مئوية و 5% CO 2 في بيئة هوميديفيد حتى تصل إلى التقاء 80%- نضح المتوسطة وتغسل الخلايا مرتين في دولبيكو ' s الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). فصل الخلايا من قارورة التي تفرخ لهم في 2 مل التربسين/يدتا في الثقافة القياسية التي تحقق شروط الحد الأدنى 5 بإيجاز التأكد من أن الخلايا قد ينفصل بنجاح في قارورة استخدام مجهر تباين ضوء/مرحلة (مع عدسة هدف X 10 ). إضافة 4 مل من الثقافة المتوسطة لتحييد رد فعل تريبسينيزيشن. نقل تعليق خلية إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل. ز الطرد المركزي في 200 x 4 دقيقة بيليه الخلايا. نضح المادة طافية، مع الحرص على عدم إزاحة بيليه ببطء. إعادة تعليق بيليه في 5 مل متوسطة. نقل قاسمة 20 ميليلتر من تعليق خلية إلى هيموسيتوميتير نظيفة وعد الخلايا باستخدام مجهر مزودة بعدسة هدف X 10- إعداد الخلايا للانفجار بوضع ثلاثة أطباق 35 مم داخل طبق 90 ملم. تسمية لها على نحو ملائم. إضافة 2 مل متوسطة إلى كل طبق 35 ملم والبذور مجموعة من 5 × 10 4 خلايا كل طبق، توزيع الخلايا بشكل متساو حول الطبق. احتضان هذه العينات التجريبية بين عشية وضحاها في ظروف الثقافة القياسية للسماح لمرفق خلية مناسبة قبل التعرض لموجة الصدمة. ملاحظة: للتصوير الفلورسنت، والخلايا يجب أن يكون المصنف على زجاج معقمة كوفيرسليبس. 2. صدمة الجمعية أنبوب 2 الرقم : تلاعب EVOC وصدمة أنبوب الجمعية. (أ) صورة من تلاعب EVOC. (ب) التخطيطي جهاز أنبوب الصدمة. تتضمن أبعاد أنبوب الصدمة قطر داخلي 59 مم وطوله إجمالي، بما في ذلك تلاعب EVOC، 4.13 م. طول أنبوب مدفوعة والإجماليات الحفار EVOC 2.71 م. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. ارتداء أحذية العمل الصلب-تو ومعطف مختبر أثناء إجراءات الجمعية. إدراج أشرطة محاذاة اثنين من خلال الثقوب الترباس اثنين وجدت في الطائرة الأفقي من شفة منفذاً. ضع ورقة طوقا مطاط النتريل على نهاية أشرطة محاذاة ذلك لأنها تقع بين شفة منفذاً وتلاعب الثقافة (EVOC) الجهاز السابقين فيفو. ملاحظة: تلاعب EVOC لاعبا مصممة خصيصا للاستخدام مع أطباق بتري 35 ملم ( الشكل 2A). إرفاق تلاعب EVOC إلى منفذ شفة الأنبوب صدمة بانزلاق لاعبا أساسيا على القضبان المحاذاة، وكفالة الموجه بشكل صحيح حيث أن القسم الذي يحمل طبق بيتري يقع عند قاعدته. إدراج أربعة مسامير M24 وغسالات في الحفر المتبقية. ضع المكسرات بحيث تلامس الشفة. أحكام ربط الصواميل والمسامير تسلسلياً على نحو متماثل قطرياً حين التحقق بصريا أن يكون الانحياز أنبوب الحفر وصدمة EVOC بنجاح. إرفاق محول ضغط إلى تلاعب EVOC وتوصيله إلى مصدر الحالية باستخدام كبل جهاز استشعار. ثم، باستخدام كابل BNC، الاتصال المصدر الحالي للذبذبات. يتم إغلاق ضمان جميع الإصدار الصمامات وتدفق عناصر التحكم على أنبوب الصدمة. فتح خط الهواء المضغوط الخارجي المدمج ويدويًا بتشغيل منظم للضغط اتجاه عقارب الساعة لشحن الملف اللولبي لشريط 2.5 فتح صمام الأمان على زجاجة غاز مضغوط بتحويلها الفيلتر 180°. ببطء تشغيل منظم الضغط، يقع على رأس زجاجة غاز، عقارب الساعة زيادة الضغط لحوالي 15 شريط ملاحظة: نقطة إعداد منظم لهذا ينبغي أن يكون قليلاً أعلاه أعلى انفجار ضغط الحجاب الحاجز سمكا الذي سيستخدم في التجربة- إعداد أغشية بقطع ورقة بلاستيكية سميكة مم 0.125 إلى مربعات 10 × 10 سم. ملاحظة: سيتم الربط بين سمك الحاجز مع ضغط انفجار، تغيير ضغط ذروة موجه الصدمة (أي غشاء سمكا سيؤدي إلى موجه الصدمة مع ضغط ذروة أكبر؛ الجدول 1). انفجر الضغط (بار) أبعاد “الحجاب الحاجز مايلر” (سم) 3 استشعار الضغط النطاق (الكوري) x 10 x 10 0.023 2 ± 0.2 47 ± 7.5 10 × 10 × 0.050 4 ± 0.2 72 ± 7.5 10 × 10 × 0.125 9.5 ± 0.5 127 ± 12.5 الجدول 1: “انفجر الضغط المقابلة” لسمك الغشاء وذروة الضغط. إنشاء مقابض خارج الشريط وإصلاحها إلى أعلى وأسفل الحجاب الحاجز، واستخدامها لوضع الحجاب الحاجز بجوار شفة صغيرة الجبهة بعناية دائرة المغلاق. التأكد من أن الحاجز مستقيم ومتوضعه بشكل صحيح قبل إغلاق المغلاق. تأمين هذا باستخدام أربعة مسامير M24 والمكسرات. أحكام ربط الصواميل والمسامير تسلسلياً على نحو متماثل قطرياً. 3. إعداد “الخلايا السابقة فقط” “التعرض لموجة الصدمة” تحضير غطاء الاندفاق الصفحي أنسجة عن طريق إجراء التعقيم الأشعة فوق البنفسجية. تنظيفه مع إيثانول الحل و 70% المطهرات. جمع جميع العناصر اللازمة للتعامل مع الخلايا السابقة إلى/ما بعد-شوك موجه التعرض ووضعها داخل غطاء معقم. ملاحظة: وهذا يشمل متوسطة جديدة ولاصقة الغاز نفاذية الأغشية ومقص العقيمة، الماصات وماصة نصائح. نقل طبق بيتري 90 ملم واحد يحتوي على ثلاث عينات تجريبية من الحاضنة إلى هود العقيمة. قطع غاز-نفاذية الأغشية لاصقة الورقة (انظر الجدول للمواد) إلى ستة مربعات، بعضها يكون كبيرا بما يكفي لتغطية الجزء العلوي من صحن بتري 35 ملم واحد. نضح المتوسطة من 35 ملم من طبق بيتري، ضع الغطاء على جانب واحد، وتغطي مع قسمين لاصقة الغاز نفاذية الأغشية، ضمان وجود ختم ضيق بين الغشاء وحافة الطبق. نقل العينة إلى تلاعب EVOC وتأمينه لقاعدة للمباراة حيث أنه تتم محاذاة أعلى الطبق بالقاعدة الداخلية للأنبوب الصدمة. 4. صدمة “عملية أنبوب” ارتداء معطف مختبر وأحذية السلامة، المدافعين عن الإذن ونظارات العين عند الضغط على هذا النظام أنبوب الصدمة. تشغيل مقبض تحكم تدفق منظم اتجاه عقارب الساعة، السماح للغاز في التدفق إلى مرنة خرطوم توصيل اسطوانة الهواء المضغوط إلى أنبوب الصدمة. في الجزء السفلي من لوحة التحكم، حدد أما " “المؤخرة مزدوجة” " مدخل للرعايا صدمة قصيرة المدةه أو " “برنامج تشغيل أنبوب” " مدخل لمدة موجه المتزايدة. التبديل على DC مصدر الطاقة والذبذبات الحصول على البيانات الموجي. تعيين معدل أخذ العينات الذبذبات إلى 50.0 MS/s، مع تسجيل طول م 1 نقطة. تعيين مجموعة من 50 أم لإطلاق النار على شريط 2 و 100 mV لاعلاه شريط 4 تشغيل الأضواء سلامة استخدام التبديل على الجدار مقابل لوحة التحكم- ملاحظة: هذا بإعلام الباحثين الآخرين لا لدخول الغرفة عند الشحن أنبوب الصدمة. تشغيل التبديل في مربع عنصر التحكم اللولبي لإغلاق الملف اللولبي. ملاحظة: هذه الميزة الأمان إغلاق صمام يقع في دائرة المغلاق مزدوجة، مما يسمح للنظام بأن تقيد. في لوحة التحكم، افتح ببطء التحكم بالانسياب بتحول مقبض الباب عقارب الساعة إلى زيادة الضغط داخل غرفة الضغط تدريجيا. مراقبة الضغط باستخدام شاشة لوحة التحكم- هو التوصل إلى عندما انفجر الضغط من الحجاب الحاجز، سوف تمزق الحجاب الحاجز، " بانج " سيتم الاستماع. إغلاق التحكم بالانسياب بسرعة عن طريق تحويل المقبض. ملاحظة: سوف يسافر موجه الصدمة على عينة الخلية ومن نهاية الأنبوب أسفل الأنبوبة. فتح الملف اللولبي عن طريق إيقاف تشغيل التبديل في مربع عنصر التحكم اللولبي وإيقاف الضوء السلامة (باستخدام رمز التبديل على الجدار مقابل لوحة التحكم)- نقل العينة الخلية إلى هود العقيمة وإزالة الغاز نفاذية أغشية لاصقة، وملء الطبق مع 2 مل متوسط نمو جديدة. الخلايا يمكن استخدامها فورا للتقييم، كما هو موضح في الخطوة 5، أو عاد إلى حاضنة للدراسات الطويلة الأجل- 5. خلية بقاء تقييم جدوى خلية عقب موجه صدمة التعرض لاستخدام تركيبة مقايسة مؤشر الأكسدة والتصوير الفلورسنت من الخلايا الحية والميتة- ملاحظة: للتصوير الفلورسنت، والخلايا يجب أن يكون المصنف على زجاج معقمة كوفيرسليبس خلال الجزء 1: الخلية إعداد الثقافة وعينه. وهذه يمكن أن توضع داخل أطباق بتري 35 ملم. نقل 200 ميليلتر من الكاشف إينديكتور الأكسدة والاختزال (انظر الجدول للمواد) موجه إلى كل طبق تجريبية مباشرة بعد إعادة الملء لهم مع 2 مل صدمة ما بعد المتوسط التعرض. احتضان في شروط الثقافة القياسية 4 ﻫ. لكل طبق، نقل (بغطاء معقم الظلام) 2 x 100 ميليلتر مختبرين أما سوداء أو امسح اللوحة 96، حسنا، اعتماداً على ما إذا كان سيتم استخدام الفلورية أو امتصاص لتقييم جدوى. نقل لوحة 96-جيدا إلى قارئ لوحة مناسبة مزودة بعوامل التصفية الصحيحة وقراءتها باستخدام الإثارة عصابات 530ex/590em للأسفار أو 570 نانومتر جنبا إلى جنب مع مرجع 600 نانومتر لامتصاص. تصدير وحفظ البيانات- تحليل البيانات لتحديد أي فارق بين العينات التي تعرضت لموجة الصدمة والضوابط غير مكشوف، كما أن هذا يمكن أن تشير إلى حدوث انخفاض في بقاء الخلية. ملاحظة: عنصر تحكم سلبية ينبغي أيضا إدراج في التصميم التجريبي. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الاستيفاء في المنحنى القياسي لحساب أرقام الخلية. نضح المتوسطة التي تحتوي على مؤشر الكاشف الأكسدة والاختزال. استبداله مع 2 مل متوسطة طازجة واحتضان الخلايا في ظروف الثقافة القياسية ل 24 h. كرر الخطوات المذكورة أعلاه إذا لزم الأمر للحصول على نقطة وقت صلاحية ثانية. للتصوير الفلورسنت من الخلايا الحية والميتة، نضح المتوسطة وتغسل الخلايا مرتين في 1 مل من برنامج تلفزيوني. نقل 100 ميليلتر الكاشف كاملة وجدت في التصوير كيت (انظر الجدول للمواد) لكل عينة واحتضان في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء على 15 دقيقة نضح الكاشف ويغسل مرة واحدة باستخدام 1 مل من برنامج تلفزيوني. استخدام الملقط نقطة غرامة، إزالة ساترة من طبق 35 ملم بعناية ووضعه الوجه للأسفل إلى شريحة مجهرية زجاج. الحصول على صور لكل عينة باستخدام مجهر فلوري (X 10 الهدف العدسة، والفتحة العددية 0.50) مزودة بعوامل التصفية الصحيحة الإثارة والانبعاثات (ex/nm nm/515 م 488 و 570 نانومتر nm/602). ملاحظة: سوف تنبعث الخلايا الحية fluorescence مكثفة، وموحدة، والأخضر. خلايا ميتة أو يموتون بغشاء خلوي الشبهة سوف الإقبال المكون عدة قتلى، أدى إلى انبعاث ومضان أحمر، وجدت أساسا في منطقة نووية الخلية. استخدام تحليل الصور البرمجيات أما يدوياً أو تلقائياً حساب عدد الخلايا الحية والميتة من كل صورة-

Representative Results

استخدام الطريقة الموصوفة أعلاه، تعرض الخلايا التي نمت في أحادي الطبقة في ثلاث نسخ إلى موجات الصدمة التي تم إنشاؤها باستخدام أنبوب صدمة (الشكل 2). وتم تقييم علامات لبقاء الخلية. استخدام مقايسة مؤشر الأكسدة، اتضح أن تطبيق موجه الصدمة 127 الجيش الشعبي الكوري استطاعت أن تقلل إلى حد كبير جدوى خلايا الحليمة الجلد بالمقارنة مع عناصر التحكم بعد 24 ساعة في الثقافة (الشكل 3). تطبيق الجيش الشعبي الكوري في دي سيفن تو موجه الصدمة لا يقلل من جدوى. لدعم هذه الملاحظات، استخدمت صورة فلورسنت مقايسة قادرة على فلوريسسينتلي وسمها خلايا حية أم ميتة مع فلوروفوريس الأخضر أو الأحمر، على التوالي،. التقدير الكمي للخلايا الحية والميتة من الصور الفلورية 13 كل تكرار البيولوجية أظهرت انخفاضا في بقاء الخلية في أولئك الذين يتعرضون لموجة الصدمة 127 الجيش الشعبي الكوري بالمقارنة مع عنصر التحكم (الشكل 4). أجريت التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA اتجاه واحد متبوعاً باختبار المقارنة متعددة في توكي مع ف < 0.05 تعتبر يعتد به إحصائيا. وبلغ حجم العينة كل مجموعة 9 للمقايسة مؤشر الأكسدة و 39 للتحليل الكمي fluorescence التصوير. الشكل 3 : مؤشر الأكسدة مقايسة بيانات توضح الوقت بالطبع من الخلية البقاء بعد التعرض لموجة الصدمة. ولوحظت خلايا أقل إلى حد كبير بعد 24 ساعة في المجموعة المعرضة لموجة الصدمة 127-الجيش الشعبي الكوري بالمقارنة مع عنصر التحكم غير المعالجة. مراقبة السلبية التي تألفت من العلاج 30-s مع 2% (انظر الجدول للمواد) أظهرت مطهر خلايا أقل كثيرا في T0 و 24 ساعة بالمقارنة مع جميع الفئات الأخرى. يمثل كل شريط يعني ± 1 الانحراف المعياري (SD)؛ البيولوجية replicates، N = 3؛ التقنية يتطابق، n = 3. ف = < 0.0001. * ف = < 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 4 : تصوير fluorescence. (أ) كمية البيانات التي جمعت من الصور الفلورية للخلايا الحية والميتة التقاطها باستخدام مجهر الأسفار في التعرض لموجة الصدمة بعد 24 ساعة. إلى حد كبير وقد لوحظت خلايا قابلة للحياة أقل في الجيش الشعبي الكوري 127 (يعني = 93.42) تعرضت لموجة الصدمة عينة مقارنة بالجيش الشعبي الكوري 47 (يعني = 98.18)، 72 كيلوباسكال (يعني = 98.87)، والتحكم في مجموعات (يعني = 99.10). ولوحظت أية خلايا قابلة للتطبيق على مجموعة المراقبة السلبية بعد 24 ساعة (يعني = 0). (ب) الأسفار الممثل الصور. الأخضر يبين الخلايا الحية، بينما يظهر الأحمر الخلايا الميتة. ويبين كل ارسم مربع quartiles العلوي والسفلي مع شعيرات توكي؛ البيولوجية replicates، N = 3؛ التقنية يتطابق، n = 13. ف = < 0.0001. شريط المقياس = 300 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

الإصابات الأولية التي تم الحصول عليها من التعرض لإحداث الانفجار لا بعد فهم فهما كاملا. تحديد وفهم الآليات التي تؤدي إلى الإصابات الناجمة عن الانفجار، مثل^،الدماغ إصابة³⁴ والتحجر هيتيروتوبيك⁶^،⁷، خطوات أولى هامة لتطوير أساليب فعالة للوقاية. للمساعدة في تحقيق هذا الهدف، وضعت عددا من النظم التجريبية لتكرار انفجار الحدث التعرض¹¹^،^،من¹²¹³^،^،من¹⁴¹⁸^،¹⁹. الأسلوب الموصوفة هنا يستخدم صدمة أنبوب معدات (الشكل 2) القادرة على إطلاق موجات الصدمة في طائفة من الضغوط في الجسم كله (أي، من القوارض)، والأنسجة، أو عينات الخلايا. القدرة على تحميل أنواع الخلايا الفردية بدلاً من الأنسجة كلها تعطي القدرة على تحليل استجابات خلوية متميزة، كما يمكن أن يحدث تلف في نفس الوقت عن طريق مجموعة من الآليات¹^،². على سبيل المثال، نموذج المؤلمة لإصابة في الدماغ، وتقييم أنواع الخلايا الفردية، مثل الخلايا العصبية وأستروسيتيس، يمكن السماح للتعرف على إصابة خلية على حدة. أيضا، يمكن تقييم استجابة الجهاز كلياً باستخدام أنسجة المخ. أنواع الخلايا الفردية وعينات الأنسجة لها قيمة ويمكن أن تعطي معلومات مختلفة. من الممكن أيضا لتغيير كمية الهواء التي يتم الضغط لتوليد الصدمة عن طريق تحديد مدخل مزدوج-المؤخرة أو برنامج تشغيل الأنبوب. وهذا يتحكم في مدة موجه الصدمة. وثمة إمكانية أخرى تغيير الحجاب الحاجز المادي وسمك لتغيير ضغط ذروة²⁵.

هي عامل آخر للنظر في آثار نهاية التدخل التي يمكن أن تكون موجودة عند إسكان عينة يقع بالقرب من خروج أنبوب الصدمة، مثل التي وجدت في تلاعب EVOC المبينة في هذا النظام. شاندرا et al. نظرت إلى ملامح موجه الانفجار وجدت في مواقع مختلفة في أنبوب يحركها ضغط صدمة ووجدت أن الموجي فريدلاندر أفضل ممثلة في مكان عميق داخل أنبوب الصدمة¹⁵. كورياكوسي et al. كما درس تحميل الثانوية من العينة ووجد أن وضع صفيحة نهاية في نهاية الأنبوب صدمة كان قادراً على القضاء على الموجات المنعكسة غير المرغوب فيها¹⁶. النظر في البيانات الموجودة في هذه المنشورات¹⁵^،¹⁶، يمكن أن تشمل التعديلات المقبلة لتحسين نظام أنبوب الصدمة الموضحة في هذه المقالة موضع تلاعب EVOC في مكان أعمق داخل الأنبوب مدفوعة أو، وبدلاً من ذلك، إدراج صفيحة نهاية على أنبوب الصدمة. ويمكن أن تشمل القيود المفروضة على طريقة وصف الإنتاجية منخفضة نسبيا من العينات. يمكن لمستخدم واحد تعمل أنبوب الصدمة بأمان في ناتج من جميع أنحاء عينات 6-8 للساعة الواحدة. في الوقت الحاضر، تم تصميم النظام حول استخدام أطباق بتري 35 ملم واحد. ولذلك، يمكن أن تكون التجارب الكبيرة التي تحتوي على العديد من المجموعات والبيولوجية replicates صعبة لتحقيق.

يوضح هذا المقال أساليب كيفية تأثر صلاحية خلايا الحليمة جلدي ملتصقة بالتعرض لموجة صدمة واحدة. موجه صدمة قصيرة المدة (< 10 مللي ثانية) من دي سيفن تو الجيش الشعبي الكوري لم يؤثر على إمكانية المقارنة مع عنصر التحكم (رقم 3 و رقم 4). في المقابل، حفزت موجه الصدمة في 127 الجيش الشعبي الكوري انخفاضا كبيرا في البقاء في الانفجار بعد 24 ساعة، كما هو موضح بكل من تحليل مؤشر الأكسدة والاختزال (الشكل 3) وتحليل الصور الفلورية (الشكل 4). ذكر ميلر et al. تخفيض مماثل في بقاء الخلية في الفئران أورجانوتيبيك شريحة هيبوكامبال الثقافات عندما تتعرض الخلايا أما 147 الجيش الشعبي الكوري أو موجه الصدمة 278 الجيش الشعبي الكوري باستخدام أنبوب مفتوح باب العضوية، يحركها الهيليوم صدمة¹⁴. وفي المقابل، أفاد فانديفورد et al. أن كان هناك أي تأثير على القدرة على البقاء في astrocytes الفئران المعرضة لَيَرْكَبُ مدة قصيرة من > 200 الجيش الشعبي الكوري، على الرغم من أن باروتشامبير تم استخدامه بدلاً أنبوب صدمة¹⁸. تجدر الإشارة إلى أن الضغط الخارجي تعتمد على موجه الانفجار، على الرغم من أن هذا يخلق موجات الإجهاد معقدة داخل الجسم، مما يجعل طبيعة التحميل تعتمد اعتماداً كبيرا على الخواص الميكانيكية للأنسجة أو الخلايا. مطلوب دراسات تحديد خصائص إضافية للاستجابة الخلوية لإحداث الانفجار. وعلاوة على ذلك، بتقييم التعرض موجه صدمة على المستوى الخلوي، كما هو مبين في هذا الأسلوب، الاستجابات البيولوجية الناجمة عن الإصابة، مثل اضطراب من إشارات المسارات أو تغييرات جينية، يمكن تحديدها والمزيد من البحث.

وفي الختام، يصف هذا العمل استخدام أنبوب الفولاذ المقاوم للصدأ صدمة ومنصة EVOC معدلة لدمج الثقافات الخلية الأولية. يمكن إنشاء موجات الصدمة في طائفة من الضغوط ونشرها عبر الخلايا الحية لتكرار التأثيرات التي تحدث من جراء التعرض لموجة انفجار. هذا البروتوكول يوضح كيفية تقييم جدوى الخلية، ولكن يمكن أيضا دراسة التغيرات الأطول أجلاً لأنواع الخلايا الفردية. تسير إلى الأمام، نحن نخطط لتقييم الآثار التفاضلية التي يمكن الحصول على موجات الصدمة المعقدة في أنواع الخلايا المختلفة، بهدف تعزيز فهمنا للإصابات الأولية الناجمة عن الانفجار.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونود أن نعترف بدعم مالي من “مركز الفيلق الملكي البريطاني” “الدراسات إصابة الانفجار” هكتار والتمويل من “مجلس البحوث الطبية” (M01858X/1) للمعهد.

Materials

MEM α, nucleosides	ThermoFisher	22571020
Fetal Bovine Serum, certified, US origin	ThermoFisher	16000044	Supplement to create complete growth media.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15070-063	Supplement to create complete growth media.
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	ThermoFisher	15400-054	Dilute 1 in 10 before use.
CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented	Starlab	CC7682-4875
TC Dish (PS) 35mm, 8.5 cm2	Triple Red	TCD010035
Petri dish (PS) 90×14.2mm no vent	VWR UK	391-0453
Gas Permeable Adhesive Plate Seals	ThermoFisher	AB-0718
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	ThermoFisher	R37601
Alamarblue cell viability reagent	Fisher Scientific	13494309
Virkon tablets	VWR UK	115-0020	Use to create 2% solution as viability control reagent.
Dumont forceps	SurgicalTools	11295-10	Use to remove coverslips from petri dish.
Cover glass, square	VWR UK	631-0125
Microscope slides	VWR UK	631-1553
96 Well plate, solid black	AppletonWoods	CC760	Plate to be used for fluorescence measurements.
96 Well plate, clear, (PS)	VWR UK	734-1799	Plate to be used for absorbance measurments.
Leica DMi1 Camera stand outfit	Leica Microsystems		Optical microscope used for cell culture.
Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton	Zeiss		Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging.
EnVision Multilabel Reader	PerkinElmer	2104-0010A	Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings.
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.023mm	RS Components	785-0782	Use to create shock tube diaphragm.
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.05mm	RS Components	785-0786	Use to creatw shock tube diaphragm.
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.125mm	RS Components	785-0798	Use to create shock tube diaphragm.
Current source power unit	Dytran Intruments Inc.	4103C	Power source for 2300V1 sensor.
IEPE Pressure Sensor	Dytran Intruments Inc.	2300V1	Pressure sensor located on shock tube.
Digital Phosphor Oscilloscope	Tektronix	DPO 4104B	Use to gather and save sensor 2300V1 data.

References

Proud, W. G. The physical basis of explosion and blast injury processes. J R Army Med Corps. 159, 4-9 (2013).
Born, C. T. Blast Trauma: The Fourth Weapon of Mass Destruction. Scand J of Surg. 94 (4), 279-285 (2005).
Kocsis, J. D., Tessler, A. Pathology of blast-related brain injury. J Rehabil Res Dev. 46 (6), 667-671 (2009).
Bass, C. R., et al. Brain Injuries from Blast. Ann Biomed Eng. 40 (1), 185-202 (2012).
Cernak, I., Kobeissy, F. H. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. , (2015).
Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. Blast injuries and heterotopic ossification. Bone Joint Res. 1 (8), 174-179 (2012).
Potter, B. K., Burns, T. C., Lacap, A. P., Granville, R. R., Gajewski, D. A. Heterotopic Ossification Following Traumatic and Combat-Related Amputations. Prevalence, Risk Factors, and Preliminary Results of Excision. J Bone Joint Surg Am. 89 (3), 476-486 (2007).
Sasser, S. M., Sattin, R. W., Hunt, R. C., Krohmer, J. Blast Lung Injury. Prehosp Emerg Care. 10 (2), 165-172 (2006).
Cho, S. -. I., et al. Mechanisms of Hearing Loss after Blast Injury to the Ear. PLoS ONE. 8 (7), 67618 (2013).
Bull, M. A., Clasper, J., Mahoney, P. . Blast Injury Science and Engineering: A Guide for Clinicians and Researchers. , (2016).
Arun, P., et al. Studies on blast traumatic brain injury using in-vitro model with shock tube. Neuroreport. 22 (8), 379-384 (2011).
Ahlers, S. T., et al. Assessment of the effects of acute and repeated exposure to blast overpressure in rodents: toward a greater understanding of blast and the potential ramifications for injury in humans exposed to blast. Front Neurol. 3, 32 (2012).
Polfer, E. M., et al. The development of a rat model to investigate the formation of blast-related post-traumatic heterotopic ossification. Bone Joint J. 97 (4), 572-576 (2015).
Miller, A. P., et al. Effects of Blast Overpressure on Neurons and Glial Cells in Rat Organotypic Hippocampal Slice Cultures. Front Neurol. 6, 20 (2015).
Chandra, N., et al. Evolution of blast wave profiles in simulated air blasts: experiment and computational modeling. Shock Waves. 22 (5), 403-415 (2012).
Kuriakose, M., et al. Tailoring the Blast Exposure Conditions in the Shock Tube for Generating Pure, Primary Shock Waves: The End Plate Facilitates Elimination of Secondary Loading of the Specimen. PLoS ONE. 11 (9), 0161597 (2016).
Reneer, D. V., et al. A Multi-Mode Shock Tube for Investigation of Blast-Induced Traumatic Brain Injury. J Neurotrauma. 28 (1), 95-104 (2011).
VandeVord, P. J., et al. Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure. Neurosci Lett. 434 (3), 247-252 (2008).
Kane, M. J., et al. Altered gene expression in cultured microglia in response to simulated blast overpressure: Possible role of pulse duration. Neurosci Lett. 522 (1), 47-51 (2012).
Nienaber, M., Lee, J. S., Feng, R., Lim, J. Y. Impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study. J Vis Exp. (56), (2011).
Zhang, J., et al. Transcriptional Profiling in Rat Hair Follicles following Simulated Blast Insult: A New Diagnostic Tool for Traumatic Brain Injury. PLoS ONE. 9 (8), 104518 (2014).
Bo, C., et al. Cellular characterization of compression-induceddamage in live biological samples. AIP Conf Proc. 1426 (1), 153-156 (2012).
Tannous, O., Griffith, C., O’Toole, R. V., Pellegrini, V. D. Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model. J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).
Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, D. F. In-Vitro Approaches for Studying Blast-Induced Traumatic Brain Injury. J Neurotrauma. 26 (6), 861-876 (2009).
Nguyen, T. T. N., Wilgeroth, J. M., Proud, W. G. Controlling blast wave generation in a shock tube for biological applications. JPCS. 500 (14), 142025 (2014).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Logan, N. J., Arora, H., Higgins, C. A. Evaluating Primary Blast Effects In Vitro. J. Vis. Exp. (127), e55618, doi:10.3791/55618 (2017).

Automatically Generated