Evaluating Primary Blast Effects <em>In Vitro</em>

Niall J. Logan; Hari Arora; Claire A. Higgins

doi:10.3791/55618

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioengineering

בהערכת פגיעה עיקריים אפקטים במבחנה

Published: September 18, 2017

doi:

10.3791/55618

Niall J. Logan¹, Hari Arora¹, Claire A. Higgins¹

¹Department of Bioengineering,Imperial College London

Summary

הבנה כיצד מאופנן של תאים על ידי חשיפה גלי הלם יכול לעזור לזהות את המנגנונים מאחורי פציעות מופעלות מאירועים הפיצוץ. פרוטוקול זה משתמש הלם לפי הזמנה צינור ציוד להחלת גלי הלם במגוון של לחצים תא monolayers, כדי לזהות את ההשפעות עוקבות על הכדאיות תא.

Abstract

חשיפה לאירועים הפיצוץ יכול לגרום טראומה קשה לאיברים חיוניים כגון הריאות, האוזניים, ו המוח. הבנת המנגנונים מאחורי פגיעות כאלה הנוצרות על-ידי הפיצוץ הוא בעל חשיבות רבה שוקל את המגמה האחרונה לקראת שימוש בחומרי נפץ לוחמה מודרנית, אירועים הקשורים לטרוריסטים. כדי להבין באופן מלא את הפיצוץ-induced פציעה, עלינו תחילה להיות מסוגלים לשכפל אירועים כאלה הפיצוץ בסביבה מבוקרת באמצעות שיטה ישימה. טכניקה זו באמצעות ציוד צינור הלם, גלי הלם במגוון של לחצים אותם ניתן להפיץ על תאים חיים גדלו ב 2D, סמנים של הכדאיות תא ניתן מיד לנתח שימוש assay מחוון של חמצון-חיזור, ההדמיה פלורסנט של תאים מתים וחיים. שיטה זו הוכיחה כי הגדלת את הלחץ הפיצוץ שיא ל 127 kPa יכול לעורר ירידה משמעותית בתוך התא הכדאיות בהשוואה פקדים ללא טיפול. הבדיקה דוגמאות אינם מוגבלים תאים חסיד, אך יכול לכלול תא המתלים, לכל הגוף ודגימת רקמות, דרך שינויים מזעריים הגדרת צינור הלם. משכפל את התנאים המדויקים רקמות ותאים להיתקל כאשר נחשף אירוע פיצוץ אמיתי קשה. טכניקות כגון האחד שהוצגו במאמר זה יכול לעזור להגדיר מיכסות נזק ולזהות את השינויים גנים ברמת השעתוק והתרגום epigenetic בתוך תאי הנובעות מחשיפה גל הלם.

Introduction

עם המגמה האחרונה לקראת שימוש מטעני חבלה לוחמה מודרנית ובפעולות טרור על אזרחים, הבנת ההשפעות של אירועים נפץ על גוף האדם הוא בעל חשיבות רבה. פציעות שהושג באמצעות חשיפה לאירועים הפיצוץ יכול להיות קטלני קטלני, עם תהליכים פיזיים של פגיעה מחולק לארבע קטגוריות. ראשי פציעות כתוצאה מחשיפה ישירה גל ההדף, אשר אינטראקציה באופן מקומי עם הגוף באופן compressive, לאחר מכן ולקיבולת, גורם השיבוש של ממברנות, רקמות רכות¹. פציעות משניות לכלול פגיעת או פצעי חדירה שנגרמו על ידי פגיעה בחפצים נמוך-המונית מונעות במהירות גבוהה על-ידי גל ההדף. פציעות שלישוני להתרחש כאשר גל ההדף יש אנרגיה מספקת כדי לזרוק חפצים של מסה גבוהה או יחידים מפני חפצים. לבסוף, פציעות הפיצוץ רבעוני מוגדרים על-ידי אחרים פציעות שונות אשר אינם מתאימים לקטגוריות האחרות, כגון כוויות פלאש². בעקבות החשיפה לאירועים שכאלה הפיצוץ, פציעות ראשי כוללים⁴^,³^,פגיעה מוחית טראומטית⁵, התקשות הטרוטופי⁶^,⁷, הפיצוץ ריאות פציעה⁸, אובדן שמיעה ⁹ועוד¹⁰.

Waveform בדרך כלל התצפיות מאירועים הפיצוץ הוא גל פרידלנדר, המייצג פיצוץ שדה חינם, להבדיל בחלל סגור. Waveform מורכב חזית הפיצוץ זה יכולה להיות מוגדרת כ עלייה חדה ומהירה בלחץ חיובי. זה ומיד אחריו על ידי רוח משב אוויר נע במהירות גבוהה, גל שחרור אשר מפחית את הלחץ מתחת רמות אטמוספרי. ואקום חלקי נשאר ליד אזור הפיצוץ הראשוני, דבר המתבטא זרם אחורי איטית של אוויר. שלבי חיוביים ושליליים של הגל (איור 1 א’) לגרום לתנועת שכיבות למשוך גל ההדף¹. כדי לסייע להבהיר את המנגנונים מאחורי פיצוץ ראשי פציעות, נוצרו גרסאות ניסיוניות לייצר ואת, כמו הגל פרידלנדר, אשר תאים ורקמות יעמדו בפני כאשר נחשף אירוע פיצוץ אמיתי. המערכות הקיימות המפורטים בספרות כוללים הלם צינורות¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷, ¹⁸^,barochambers¹⁹בר קולסקי²⁰, סימולטורים מתקדמים הפיצוץ²¹, פיצול Hopkinson לחץ בר²², הבילוי של אירועים אלטרנטיביים הפיצוץ בעזרת סביבה מבוקרת pentaerythritol tetranitrate²³. למרות המגוון הרחב של הדגמים, משתנים רבים להשפיע על הפגיעה המתקבל גלי ההדף, כולל הלחץ טרום שהוחלה, ואת התכונות המכאניות של, סוגי תאים בודדים או רקמות תחת הערכה²⁴. בעוד המחקר של הרקמות או האיברים יכולה לשפוך אור על רקמות דפורמציה ושינויים מורפולוגיים ברוטו נגרם בעקבות הפיצוץ אירועים, ניתוח ברמה התאית יכול לחשוף שינויים epigenetic תעתיק מושפע גל ההלם.

במאמר זה-שיטות טכניקה להפיץ גלי הלם במגוון של לחצים על תאים חיים טפט. דבר זה מאפשר אפיון הכדאיות תא, שחקרתי ספי נזק פוטנציאלי של גלי הלם מיידית. יתר על כן, התאים קיימא שאפשר יהיה להחזיר את התנאים תרבות רגיל, השפעות ביולוגיות לטווח ארוך מן האירוע הפיצוץ יכול להיות מוערך. להלן הפרוטוקול מתאר שתי טכניקות הכדאיות התא יכול לשמש בתאי בתרבות.

איור 1: קירוב של גל פרידלנדר. (א) הערכה של גל פרידלנדר נצפו על חיישן 3 ברכבת התחתית הלם. (B) נציג נתונים מציג את הפרופילים לחץ שונות נצפו על חיישנים 1, 2 ו- 3 על המרקע הלם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Protocol

1. תרבית תאים, הכנת הדוגמא קבל קו תאים מתאים (למשל, תאים papilla עורי). הערה: הפרוטוקול הנוכחי תוכנן עבור תאים חסיד, עם עכברוש papilla עורי fibroblasts מבודד vibrissae שימשה כמודל. התרבות התאים בקבוקון T-75 המכילים מינימום חיוניות בינונית (מאמ) α בתוספת סרום שור עוברית 10%, 1% פניצילין סטרפטומיצין. לשמור את התאים תנאים סטנדרטיים תרבות של 37 ° C ו- 5% CO 2 בסביבה humidified עד שיגיעו למפגש 80%. תשאף המדיום ולשטוף פעמיים בתאים Dulbecco ' s באגירה פוספט תמיסת (PBS). מביצועם תאים מן הבקבוק מאת המקננת בהם ב- 2 מ של טריפסין/EDTA על תקן התרבות תנאים 5 דק בקצרה בדוק כדי לוודא כי התאים יש לזהויות בהצלחה הבקבוקון באמצעות מיקרוסקופ אור/שלב ניגודיות (עם עדשה המטרה X 10 ). להוסיף 4 מ”ל של תרבות מדיום כדי לנטרל. את התגובה trypsinization. להעביר את המתלים תא שפופרת צנטרפוגה 15 mL- צנטריפוגה-200 x גרם במשך 4 דקות על גלולה התאים. לאט לאט וארוקן את תגובת שיקוע, מטפל לא לנתק את גלולה. מחדש להשעות את צניפה ב 5 מ ל בינונית. העברה של aliquot 20 µL של התליה תא hemocytometer נקי ולספור את התאים באמצעות מיקרוסקופ מצוידים עדשה המטרה X 10- להכין את התאים הפיצוץ על ידי הצבת שלוש מנות 35 מ מ בתוך תבשיל 90 מ מ. תווית אותם כראוי. להוסיף 2 מיליליטר בינוני כל מנה 35 מ מ, זרע סך של 5 x 10 תאים 4 לכל תבשיל, הפצת התאים באופן שווה סביב המנה. דגירה הדגימות ניסיוני ללון בתנאים תרבות רגיל כדי לאפשר תא נאותה מצורף לפני גל הלם החשיפה. הערה: עבור הדמיה פלורסנט, תאים חייב להיות נזרע על coverslips זכוכית סטריליים דקה. 2. הלם צינור הרכבה איור 2 : EVOC מעטה והלם צינור הרכבה. (א) תמונה של המתקן EVOC. תיאור סכמטי של המנגנון צינור הלם (B). הלם צינור מידות כוללים של קוטר פנימי של 59 מ מ, אורך כולל, לרבות המתקן EVOC, של 4.13 מ’. אורך הצינור מונחה ועל הסכומים מעטה EVOC 2.71 מ’ אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. ללבוש נעלי עבודה הבוהן פלדה ומעיל מעבדה במהלך ההליכים הרכבה. הוספה פסי היישור שני דרך החורים בולט שני נמצא במישור האופקי של-והסתיר שקע. הנח גיליון אטם גומי nitrile מעל לקצה של פסי היישור כך שיישב בין מקורבות לשקע את המתקן התרבות (EVOC) איברים ex-vivo. הערה: המתקן EVOC הוא אביזר אישית מעוצבת מיועד לשימוש עם צלחות פטרי 35 מ מ ( איור 2 א). לצרף המתקן EVOC והסתיר לשקע הצינור הלם על-ידי הזזת את הנורה על פסי היישור, ולהבטיח כי היא orientated כראוי כך המקטע המכיל הפטרי ממוקם בבסיסו. הוסף ארבע דסקיות ואומים רמינגטון M24 לתוך החורים הנותרים. מקם את האגוזים כך נוגעים והסתיר את. בצורה הדוקה הדקו הקונצפט ברצף בצורה סימטרית באלכסון בזמן בדיקת ויזואלית כי הצינור מעטה והלם EVOC בהצלחה התיישר. לצרף מתמר לחץ המתקן EVOC וחבר אותו למקור הנוכחי באמצעות כבל חיישן. לאחר מכן, באמצעות כבל BNC, להתחבר מקור הנוכחי אוסצילוסקופ. ודא כי כל שחרור שסתומי וזרימה שולטת על המרקע הלם סגורים. פתח קו מובנה חיצוני גז דחוס, לבטל באופן ידני את וסת הלחץ בכיוון השעון, כדי לחייב את ברז חשמלי כדי 2.5 אנחנו חיים פתח את שסתום בטיחות על הבקבוק גז דחוס על-ידי הפעלתו התרחקותו 180°. . תסתובב לאט את וסת הלחץ, ממוקם על הבקבוק גז, בכיוון השעון, כדי להגביר את הלחץ על 15 אנחנו חיים הערה: מטרת הגדרה זו הרגולטור צריך מעט מעל הגבוה ביותר מתפוצץ הלחץ של הסרעפת העבה ביותר זה ייעשה הניסוי. להכין את דיאפרגמות על ידי חיתוך גיליון פלסטיק בעובי מ מ 0.125 לריבועים 10 ס”מ x 10 ס”מ. הערה: העובי של הסרעפת לתאם עם הלחץ המתפרצת, שינוי הלחץ שיא של גל ההלם (קרי, בדיאפרגמה עבה יותר תגרום גל הלם עם לחץ שיא גדול יותר; טבלה 1). מיילר הסרעפת מידות (ס”מ) פרץ לחץ (בר) טווח הלחץ חיישן 3 (kPa) x 10 x 10 0.023 2 ± 0.2 47 ± 7.5 10 x 10 x 0.050 4 ± 0.2 72 ± 7.5 10 x 10 x 0.125 9.5 ± 0.5 127 ± 12.5 טבלה 1: פרץ הלחץ המתאים עובי הסרעפת, שיא הלחץ. צור ידיות מתוך הקלטת, לתקנם כדי העליון והתחתון של הסרעפת, ולהשתמש בהם למקם בזהירות הסרעפת ליד-והסתיר קטן קבלה על ידי תא עכוז. להבטיח כי הסרעפת היא ישר והוצבו כראוי לפני סגירת עכוז. לאבטח את באמצעות ארבעה רמינגטון M24 ואומים. בצורה הדוקה הדקו הקונצפט ברצף בצורה סימטרית באלכסון. 3. הכנה של תאים רגע לפני גל הלם החשיפה הכן תא רקמת למינארי על-ידי ביצוע עיקור אולטרה סגול. . לנקות את זה עם אתנול חיטוי פתרון ו- 70%. לאסוף את כל הפריטים הדרושים לצורך טיפול תאים מוקדמת כדי/פוסט-shock גל חשיפה ומניחים אותם בתוך המנוע סטרילי. הערה: זה כולל בינוני טריים, קרום חדיר גז דבק, מספריים סטרילי, פיפטות, פיפטה טיפים. העברת 90 מ מ פטרי צלחת אחת המכילה שלוש ניסיוני דגימות החממה מכסה המנוע סטרילי. את החלק קרום חדיר גז דבק גיליון (ראה את הטבלה של חומרים) שישה ריבועים, כך כל אחד הוא גדול מספיק כדי לכסות את החלק העליון של 35 מ מ אחד פטרי. תשאף האמצעי 35 מ מ פטרי, למקם את המכסה לצד אחד, לכסות עם שני קטעים דבק ממברנות גז-חדיר, המבטיח כי יש חותם צר בין הקרום הקצה של המנה. להעביר את הדגימה המתקן EVOC ואבטח אותו לבסיס של הנורה, כך העליון של המנה מיושר עם הבסיס הפנימי של הצינור הלם. 4. הלם צינור מבצע לובש מגיני אוזניים, העין משקפי מגן, נעלי בטיחות, מעיל מעבדה מתאים לחץ מערכת הרכבת התחתית הלם. סובב את כפתור בקרת זרימה על הרגולטורים בכיוון השעון, ומאפשר גז לזרום לתוך הצינור גמיש חיבור את הצילינדר באוויר דחוס ברכבת התחתית הלם. בחלק התחתון של החלונית ‘ בקרה ‘, בחר " עכוז כפול " כניסת עבור wav משך קצר הלםe או " Tube התקן " כניסת עבור משך הגל מוגבר. מתג על מקור כוח DC, אוסצילוסקופ לרכוש את הנתונים waveform. הגדרת קצב הדגימה אוסצילוסקופ 50.0 MS/s, עם אורך הרשומה של 1 מ’ נקודות. הגדר טווח 50 mV עבור ירי בבר 2 ו- 100 mV עבור מעל 4 אנחנו חיים להדליק את האורות בטיחות שימוש בבורר על הקיר שמול הבקרה. הערה: זה אומר חוקרים אחרים לא להכנס לחדר בעת טעינת הצינור הלם. להפעיל את המתג על תיבת בקרת ברז חשמלי כדי לסגור את ברז חשמלי. הערה: תכונה זו בטיחות נסגר שסתום ממוקם על החדר עכוז כפול, המאפשר למערכת להיות טעונה. על לוח הבקרה, לאט פתח את בקרת הזרימה על-ידי הפעלת הידית נגד כיוון השעון כדי להגדיל בהדרגה את הלחץ בתוך החדר דחיסה. לפקח על הלחץ שימוש בתצוגת לוח הבקרה. ברגע הסרעפת פרץ לחץ מתמלאת, הסרעפת יתבקע ו a " באנג " תשמע. לסגור במהירות את בקרת הזרימה על-ידי הפעלת הידית. הערה: גל ההלם ייסעו דרך צינור על המדגם תא, החוצה את קצה הצינורית. לפתוח את ברז חשמלי על-ידי ביטול הבורר על הקופסא פקד סולנואיד, כבה את האור בטיחות (באמצעות הבורר על הקיר שמול לוח הבקרה). להעביר את הדגימה תא מכסה המנוע סטרילי, להסיר את הקרומים גז-חדיר דבק ולאחר למלא קערה עם 2 מ של מדיום הגידול טריים. התאים שניתן להשתמש מיד להערכה, כפי שמתואר בשלב 5 או חזר החממה ללימודי וקהילותיהם. 5. תא הכדאיות להעריך תא הכדאיות בעקבות חשיפה גל הלם באמצעות שילוב assay מחוון של חמצון-חיזור עם פלורסנט ההדמיה של תאים חיים וגם מתים. הערה: עבור הדמיה פלורסנט, תאים חייב להיות נזרע על coverslips זכוכית סטריליים דקה במהלך פרק 1: תא הכנה תרבות, לדוגמה. ניתן להציב בתוך צלחות פטרי 35 מ מ. µL 200 העברה מהתרכובת indictor חמצון-חיזור (ראה את הטבלה של חומרים) לכל מאכל ניסיוני ישירות לאחר מילוי אותם עם 2 מ”ל של הלם שלאחר בינוני גל חשיפה. דגירה-תרבות רגיל תנאים 4 h. על כל מנה, להעביר (בשכונה סטרילי כהה) 2 x 100 µL aliquots או שחור או לנקות צלחת 96-ובכן, תלוי אם זריחה או ספיגת ישמש להערכת הכדאיות. להעביר את הצלחת 96-ובכן בקורא צלחות מתאימות מצויד המסננים הנכון ולקרוא באמצעות עירור להקות 530ex/590em עבור זריחה או 570 nm בשילוב עם הפניה 600 ננומטר על ספיגת. לייצא ולשמור את הנתונים. לנתח את הנתונים כדי לזהות הבדל כלשהו בין דגימות החשופים גל הלם ופקדי שאינו חשוף, כמו זה יכול להצביע על ירידה ב תא הכדאיות. הערה: פקד שלילי גם להיכלל הנבחנים. יתר על כן, האינטרפולציה של עיקול רגיל יכול לשמש כדי לחשב את מספרי הטלפון הנייד. תשאף המדיום המכיל הכימית מחוון חמצון-חיזור. להחליף אותו עם 2 מיליליטר בינוני טריים, דגירה התאים-תנאים סטנדרטיים תרבות 24h. חזור על השלבים שלעיל לפי הצורך כדי לקבל נקודת הזמן הכדאיות השני. עבור ההדמיה פלורסנט של תאים מתים וחיים, תשאף המדיום ולשטוף פעמיים בתאים 1 מ”ל ל- PBS. העברת 100 µL מהתרכובת מלאה נמצאו ההדמיה קיט (ראה את הטבלה של חומרים) כדי שכל דוגמית, דגירה בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור במשך 15 דקות תשאף הכימית ולשטוף לאחר שימוש 1 מ”ל ל- PBS. בעזרת מלקחיים הצבע בסדר, בזהירות להסיר את coverslip של המנה 35 מ מ ומניחים אותו, פנים כלפי מטה על זכוכית מיקרוסקופ. ידרשו תמונות עבור כל דגימה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (המטרה 10x עדשה, 0.50 מפתח נומרי) מצוידים עם המסננים עירור, פליטה (ex / em 488 ננומטר/515 nm ו 570 nm nm/602). הערה: תאים חיים פולט קרינה פלואורסצנטית אינטנסיבי, אחיד, ירוק. תאים מת או גוסס עם הממברנה התאית נפגעת תהיה ספיגת הרכיב ערכת מת, וכתוצאה מכך פליטת פלואורסצנטי אדום, נמצא בעיקר באזור גרעיני התא. השתמש וניתוח תמונות תוכנה גם באופן ידני או אוטומטי לספור את מספר תאים מתים וחיים של כל תמונה.

Representative Results

באמצעות השיטה המתוארת לעיל, תאים גדל של טפט נחשפו שהפקידים על גלי הלם שנוצר באמצעות צינור הלם (איור 2B). סמנים של הכדאיות תא היו העריכו. שימוש assay מחוון של חמצון-חיזור, התברר כי היישום של גל הלם 127 kPa היה מסוגל להקטין משמעותית את הכדאיות של תאים papilla עורי לעומת שולט לאחר 24 שעות בתרבות (איור 3). היישום של kPa ≤72 גל הלם לא להפחית הכדאיות. כדי לתמוך תצפיות אלה, התמונה פלורסנט assay מסוגל fluorescently labelling תא חי או מת עם fluorophores ירוק או אדום, בהתאמה, היה בשימוש. כימות של תאים מתים וחיים מתמונות פלורסנט 13 לכל שכפול ביולוגי הפגינו ירידה תא הכדאיות אלה נחשפים גל ההלם 127 kPa בהשוואה הפקד (איור 4). ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ANOVA בכיוון אחד ואחריו מבחן השוואה מרובים של Tukey, עם p < 0.05 השפעה משמעותית מבחינה סטטיסטית. גודל המדגם לכל קבוצה הסתכם בכ 9 עבור וזמינותו מחוון חמצון-חיזור ועוד 39 לניתוח הדמיה פלורסצנטיות כמותית. איור 3 : חמצון-חיזור מחוון Assay הנתונים מציג מסלול הזמן של תא הכדאיות לאחר חשיפה גל הלם. באופן משמעותי פחות תאים נצפו לאחר 24 שעות ביממה, 127-kPa החשופים גל הלם בקבוצה בהשוואה הפקד אינו מטופל. הפקד שלילי כללה טיפול 30-s עם 2% חומר חיטוי (ראה טבלה של החומרים) הראה באופן משמעותי פחות תאים-T0 והן 24 שעות בהשוואה לקבוצות אחרות. כל עמודה מייצגת את סטיית התקן זאת אומרת ± 1 (SD); משכפל ביולוגי, N = 3; טכני משכפל, n = 3. = p < 0.0001. * = p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4 : זריחה הדמיה- (א) נתונים כמותיים שנאספו פלורסנט תמונות של תאים מתים וחיים שנלכדה באמצעות מיקרוסקופ זריחה ב- 24 שעות גל הלם שלאחר חשיפה. באופן משמעותי פחות התאים קיימא נצפתה של kPa 127 (מתכוון = 93.42) מדגם גל הלם חשופים בהשוואה של kPa 47 (מתכוון = 98.18), 72 kPa (מתכוון = 98.87), ולשלוט קבוצות (מתכוון = 99.10). לא התאים קיימא נצפו על קבוצת הביקורת השלילית לאחר 24 שעות (כלומר = 0). תמונות נציג קרינה פלואורסצנטית (B). ירוק מראה תאים חיים, בעוד האדום מראה תאים מתים. כל חלקה תיבת מראה את רביעונים העליון והתחתון עם שפם Tukey; משכפל ביולוגי, N = 3; טכני משכפל, n = 13. = p < 0.0001. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

פציעות העיקרי שהושג מחשיפה לאירועי הפיצוץ אינם עדיין לגמרי מובנים. זיהוי של הבנת המנגנונים שגורמים להופעת פציעות הנוצרות על-ידי הפיצוץ, כמו פגיעה מוחית טראומטית³^,⁴ והתקשות הטרוטופי⁶^,⁷, הם הצעדים הראשונים חשוב להתפתחות שיטות יעילות של טיפול מונע. על מנת להשיג מטרה זו, פותחו מספר מערכות ניסויות כדי לשכפל את הפיצוץ אירוע חשיפה¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁸^,¹⁹. בטכניקה המתוארת כאן משתמש הלם צינור ציוד (איור 2) מסוגל לירות גלי הלם במגוון של לחצים לכל הגוף (קרי, מכרסם), רקמות או דגימות תאים. היכולת לטעון סוגי תאים בודדים ולא כל רקמות נותן את היכולת לנתח את התגובות הסלולר ברורים, כמו נזק יכול להתרחש במקביל באמצעות מגוון של מנגנונים¹^,². לדוגמה, ליצור מודל טראומטי פגיעה מוחית, את ההערכה של סוגי תא בודד, כמו נוירונים האסטרוציטים, באפשרותך לאפשר לצורך זיהוי תאים ספציפיים פציעה. בנוסף, התגובה כולה-איבר יכול להיות מוערך באמצעות רקמת המוח. את סוגי תאים בודדים והן דגימות רקמה יש ערך, יכול לתת מידע שונה. זה גם אפשרי לשנות את כמות אוויר בלחץ כדי להפיק ההלם על-ידי בחירת לים כפול-עכוז או מנהל התקן-שפופרת. קובע את משך הזמן של גל ההלם. אפשרות אחרת היא לשנות את החומר הסרעפת ואת עובי לשנות את הלחץ שיא²⁵.

גורם נוסף שיש לקחת בחשבון תופעות הפרעות קצה זה יכול להיות נוכח בעת הדיור המדגם הינו ממוקם ליד היציאה של הרכבת התחתית הלם, כגון אלה שנמצאו על האסדה EVOC המתוארות המערכת הנוכחית. צ’אנדרה. et al. הביט פרופילים גל ההדף שנמצאו במקומות שונים על צינור הלם מונחה דחיסה ומצא waveform פרידלנדר היה מיוצג בצורה הטובה ביותר במיקום עמוק בתוך ה-tube הלם¹⁵. . Kuriakose et al. גם למד משני הטעינה של המדגם ומצא כי הצבת צלחת סוף בסוף הצינור הלם היה מסוגל לחסל גלים משתקף לא רצויים¹⁶. בהתחשב בנתונים נמצאו אלה¹⁵^,פרסומים¹⁶, שינויים בעתיד על מנת לשפר את מערכת הרכבת התחתית הלם המתוארות במאמר זה יכול לכלול את המיקום של המתקן EVOC במיקום עמוק יותר בתוך הצינור מונע או, לחלופין, ההכללה של צלחת סוף ברכבת התחתית הלם. מגבלות של השיטה המתוארת עשוי לכלול את התפוקה נמוכה יחסית של דגימות. משתמש בודד יכול לפעול הצינור הלם בבטחה על פלט של סביב 6-8 דגימות לשעה. כיום, המערכת מיועדת סביב השימוש יחיד 35 מ מ פטרי. לכן, ניסויים גדול המכיל מספר קבוצות ומשוכפלת ביולוגי יכול להיות קשה להשיג.

מאמר זה שיטות מראה איך הכדאיות של תאים חסיד papilla עורי היה מושפע על ידי חשיפה גל הלם יחיד. גל הלם משך קצר (< 10 ms) של ≤72 kPa לא השפיע על הכדאיות בהשוואה הפקד (איור 3 ו- 4 באיור). לעומת זאת, גל הלם ב kPa-127 גירוי ירידה משמעותית הכדאיות ב 24 שעות שלאחר הפיצוץ, כפי שמוצג על ידי חמצון-חיזור מחוון assay (איור 3) והן ניתוח תמונות פלורסנט (איור 4). . מילר ואח דיווחו ירידה דומה תא הכדאיות בתרבויות בהיפוקמפוס פרוסה של עכברוש organotypic כאשר תאים נחשפו גם 147 kPa או גל הלם 278 kPa באמצעות שפופרת של שוק פתוח, מונחה הליום¹⁴. לעומת זאת, VandeVord. ואח דיווחו כי שם אין השפעה על יכולת הקיום של עכברוש האסטרוציטים נחשפים הלחץ משך קצר של > 200 kPa, למרות barochamber שימש במקום שפופרת הלם¹⁸. יצוין, כי הלחץ החיצוני הוא מסתמך על גל ההדף, למרות זו יוצרת גלי הלחץ מורכבות בתוך הגוף, ולכן עושה הטבע ההעמסה תלויות במידה רבה על התכונות המכאניות של רקמות או התא. מחקרים נוספים אפיון של התגובה התאית לאירועים הפיצוץ נדרש. יתר על כן, על-ידי הערכת חשיפה גל הלם ברמה התאית, כפי שמוצג בטכניקה זו, תגובות ביולוגיות מופעלות מהפציעה, כגון ההפרעות של איתות המסלולים או שינויים epigenetic, יכול להיות מזוהה, בטיולי.

לסיכום, עבודה זו מתארת את השימוש צינור נירוסטה הלם מעטה EVOC ששונה כדי לשלב התא הראשי תרבויות. גלי הלם במגוון של לחצים יכול להיות שנוצר, הם מופצים על תאים חיים כדי לשכפל את תופעות המתרחשות מחשיפה גל הדף. פרוטוקול זה מדגים כיצד להעריך את הכדאיות התא, אך גם ניתן יהיה ללמוד שינויים וקהילותיהם סוגי תאים בודדים. הולך קדימה, אנו מתכננים להעריך את האפקטים דיפרנציאל מורכבות גלי הלם יכול להפיק סוגי תאים שונים, במטרה לקדם את ההבנה שלנו של הפיצוץ-induced פציעות העיקרי.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות על התמיכה הכלכלית של מרכז הלגיון הבריטי המלכותי ללימודי פגיעה הפיצוץ HA, מימון של המועצה למחקר רפואי (M01858X/1) היפרפלזיה מולדת של האדרנל.

Materials

MEM α, nucleosides	ThermoFisher	22571020
Fetal Bovine Serum, certified, US origin	ThermoFisher	16000044	Supplement to create complete growth media.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15070-063	Supplement to create complete growth media.
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	ThermoFisher	15400-054	Dilute 1 in 10 before use.
CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented	Starlab	CC7682-4875
TC Dish (PS) 35mm, 8.5 cm2	Triple Red	TCD010035
Petri dish (PS) 90×14.2mm no vent	VWR UK	391-0453
Gas Permeable Adhesive Plate Seals	ThermoFisher	AB-0718
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	ThermoFisher	R37601
Alamarblue cell viability reagent	Fisher Scientific	13494309
Virkon tablets	VWR UK	115-0020	Use to create 2% solution as viability control reagent.
Dumont forceps	SurgicalTools	11295-10	Use to remove coverslips from petri dish.
Cover glass, square	VWR UK	631-0125
Microscope slides	VWR UK	631-1553
96 Well plate, solid black	AppletonWoods	CC760	Plate to be used for fluorescence measurements.
96 Well plate, clear, (PS)	VWR UK	734-1799	Plate to be used for absorbance measurments.
Leica DMi1 Camera stand outfit	Leica Microsystems		Optical microscope used for cell culture.
Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton	Zeiss		Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging.
EnVision Multilabel Reader	PerkinElmer	2104-0010A	Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings.
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.023mm	RS Components	785-0782	Use to create shock tube diaphragm.
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.05mm	RS Components	785-0786	Use to creatw shock tube diaphragm.
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.125mm	RS Components	785-0798	Use to create shock tube diaphragm.
Current source power unit	Dytran Intruments Inc.	4103C	Power source for 2300V1 sensor.
IEPE Pressure Sensor	Dytran Intruments Inc.	2300V1	Pressure sensor located on shock tube.
Digital Phosphor Oscilloscope	Tektronix	DPO 4104B	Use to gather and save sensor 2300V1 data.

References

Proud, W. G. The physical basis of explosion and blast injury processes. J R Army Med Corps. 159, 4-9 (2013).
Born, C. T. Blast Trauma: The Fourth Weapon of Mass Destruction. Scand J of Surg. 94 (4), 279-285 (2005).
Kocsis, J. D., Tessler, A. Pathology of blast-related brain injury. J Rehabil Res Dev. 46 (6), 667-671 (2009).
Bass, C. R., et al. Brain Injuries from Blast. Ann Biomed Eng. 40 (1), 185-202 (2012).
Cernak, I., Kobeissy, F. H. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. , (2015).
Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. Blast injuries and heterotopic ossification. Bone Joint Res. 1 (8), 174-179 (2012).
Potter, B. K., Burns, T. C., Lacap, A. P., Granville, R. R., Gajewski, D. A. Heterotopic Ossification Following Traumatic and Combat-Related Amputations. Prevalence, Risk Factors, and Preliminary Results of Excision. J Bone Joint Surg Am. 89 (3), 476-486 (2007).
Sasser, S. M., Sattin, R. W., Hunt, R. C., Krohmer, J. Blast Lung Injury. Prehosp Emerg Care. 10 (2), 165-172 (2006).
Cho, S. -. I., et al. Mechanisms of Hearing Loss after Blast Injury to the Ear. PLoS ONE. 8 (7), 67618 (2013).
Bull, M. A., Clasper, J., Mahoney, P. . Blast Injury Science and Engineering: A Guide for Clinicians and Researchers. , (2016).
Arun, P., et al. Studies on blast traumatic brain injury using in-vitro model with shock tube. Neuroreport. 22 (8), 379-384 (2011).
Ahlers, S. T., et al. Assessment of the effects of acute and repeated exposure to blast overpressure in rodents: toward a greater understanding of blast and the potential ramifications for injury in humans exposed to blast. Front Neurol. 3, 32 (2012).
Polfer, E. M., et al. The development of a rat model to investigate the formation of blast-related post-traumatic heterotopic ossification. Bone Joint J. 97 (4), 572-576 (2015).
Miller, A. P., et al. Effects of Blast Overpressure on Neurons and Glial Cells in Rat Organotypic Hippocampal Slice Cultures. Front Neurol. 6, 20 (2015).
Chandra, N., et al. Evolution of blast wave profiles in simulated air blasts: experiment and computational modeling. Shock Waves. 22 (5), 403-415 (2012).
Kuriakose, M., et al. Tailoring the Blast Exposure Conditions in the Shock Tube for Generating Pure, Primary Shock Waves: The End Plate Facilitates Elimination of Secondary Loading of the Specimen. PLoS ONE. 11 (9), 0161597 (2016).
Reneer, D. V., et al. A Multi-Mode Shock Tube for Investigation of Blast-Induced Traumatic Brain Injury. J Neurotrauma. 28 (1), 95-104 (2011).
VandeVord, P. J., et al. Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure. Neurosci Lett. 434 (3), 247-252 (2008).
Kane, M. J., et al. Altered gene expression in cultured microglia in response to simulated blast overpressure: Possible role of pulse duration. Neurosci Lett. 522 (1), 47-51 (2012).
Nienaber, M., Lee, J. S., Feng, R., Lim, J. Y. Impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study. J Vis Exp. (56), (2011).
Zhang, J., et al. Transcriptional Profiling in Rat Hair Follicles following Simulated Blast Insult: A New Diagnostic Tool for Traumatic Brain Injury. PLoS ONE. 9 (8), 104518 (2014).
Bo, C., et al. Cellular characterization of compression-induceddamage in live biological samples. AIP Conf Proc. 1426 (1), 153-156 (2012).
Tannous, O., Griffith, C., O’Toole, R. V., Pellegrini, V. D. Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model. J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).
Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, D. F. In-Vitro Approaches for Studying Blast-Induced Traumatic Brain Injury. J Neurotrauma. 26 (6), 861-876 (2009).
Nguyen, T. T. N., Wilgeroth, J. M., Proud, W. G. Controlling blast wave generation in a shock tube for biological applications. JPCS. 500 (14), 142025 (2014).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Logan, N. J., Arora, H., Higgins, C. A. Evaluating Primary Blast Effects In Vitro. J. Vis. Exp. (127), e55618, doi:10.3791/55618 (2017).

Automatically Generated