Evaluating Primary Blast Effects <em>In Vitro</em>

Niall J. Logan; Hari Arora; Claire A. Higgins

doi:10.3791/55618

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Bioengineering

Évaluation primaire Blast effets In Vitro

Published: September 18, 2017

doi:

10.3791/55618

Niall J. Logan¹, Hari Arora¹, Claire A. Higgins¹

¹Department of Bioengineering,Imperial College London

Summary

Comprendre comment les cellules sont modulés par l’exposition aux ondes de choc peut aider à identifier les mécanismes derrière les blessures déclenchés des événements de l’explosion. Ce protocole utilise le matériel de tube de choc sur mesure pour appliquer des ondes de choc à une gamme de pressions aux monocouches de cellules et d’identifier les effets ultérieurs sur la viabilité des cellules.

Abstract

Exposition aux événements de souffle peut causer un traumatisme grave des organes vitaux comme les poumons, les oreilles et cerveau. Compréhension des mécanismes à l’origine de ces blessures induite par l’explosion est d’une grande importance compte tenu de la tendance récente à l’utilisation d’explosifs dans modern warfare et incidents liés à des activités terroristes. Pour comprendre pleinement les dommages causés par l’explosion, nous devons tout d’abord être capables de se répliquer ces événements souffle dans un environnement contrôlé à l’aide d’une méthode reproductible. Dans cette technique à l’aide de matériel de tube de choc, ondes de choc à une gamme de pressions peuvent être propagées sur des cellules vivantes, cultivés en 2D et marqueurs de viabilité cellulaire peuvent être immédiatement analysés à l’aide d’un test d’indicateur rédox et l’imagerie de fluorescence des cellules vivantes et mortes. Cette méthode a démontré qu’augmentant la surpression d’explosion pic à 127 kPa peut favoriser une baisse significative dans la viabilité des cellules par rapport aux témoins non traités. Échantillons d’essai ne se limitent pas aux cellules adhérentes, mais peut inclure des suspensions cellulaires, échantillons dans tout l’organisme et les tissus, grâce à légères modifications à la configuration de tube de choc. Il est difficile de reproduire les conditions exactes que les tissus et cellules d’expérience lorsqu’il est exposé à un événement de véritable explosion. Des techniques telles que celle présentée dans cet article peuvent aider à définir des seuils de nuisibilité et identifier les changements transcriptionnelles et épigénétiques dans les cellules qui se posent à l’exposition de l’onde de choc.

Introduction

Avec la récente tendance à l’utilisation d’engins explosifs improvisés dans modern warfare et des actions terroristes contre des civils, comprendre les effets des événements explosifs sur le corps humain est d’une grande importance. Blessures obtenues par exposition aux événements de souffle peuvent être mortelle et mortelle, avec les processus physiques de blessures étant divisés en quatre catégories. Primaire se traduisant d’une exposition directe à l’onde de choc, qui interagit localement avec le corps d’une manière compression et par la suite expansive, provoquant la rupture des membranes et des tissus mous¹. Lésions secondaires incluent un traumatisme contondant ou pénétration blessures causés par l’impact avec des objets de faible masse propulsés à grande vitesse de l’onde de choc. Tertiaires blessures se produisent lorsque l’onde de choc suffisamment d’énergie pour jeter des objets de masse élevée ou des individus contre les objets. Enfin, les blessures blast quaternaire sont définies par autres blessures diverses qui ne rentrent pas les autres catégories, telles que des brûlures flash². Après une exposition à de tels événements blast, dommages primaires incluent traumatisme cérébral lésion³^,⁴^,⁵, ossification hétérotopique⁶^,⁷, blast pulmonaire blessure⁸, perte d’audition ⁹et autres¹⁰.

Une forme d’onde couramment observé d’événements blast est la vague de Friedlander, représentant une explosion de champ libre, par opposition à un espace clos. L’onde se compose d’un front d’explosion qui peut être défini comme une augmentation rapide et forte pression positive. Elle est immédiatement suivie d’un vent du souffle de l’air se déplaçant à grande vitesse et une vague de libération qui réduit la pression au-dessous des niveaux atmosphériques. Un vide partiel est laissé à la région de l’explosion initiale, qui se traduit par le lent reflux d’air. Les phases positives et négatives de l’onde (Figure 1 a) entraîner le mouvement de va-et-vient du souffle vague¹. Pour aider à élucider les mécanismes derrière les blessures de l’explosion primaire, modèles expérimentaux ont été créés pour produire des formes d’onde, tels que la vague de Friedlander, qui les cellules et les tissus devra faire face lorsqu’il est exposé à un événement de véritable explosion. Les systèmes actuels répertoriées dans la littérature incluent choc tubes¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷, barochambers¹⁸^,¹⁹, la Kolsky bar²⁰, souffle avancé simulateurs²¹, le Split Hopkinson pression bar²²et la reconstitution des événements alternatifs souffle dans un environnement contrôlé à l’aide Tétranitrate de pentaérythrite²³. Malgré la vaste gamme de modèles disponibles, plusieurs variables influent sur la blessure provenant des ondes de souffle, y compris le stress avant rapprochée et les propriétés mécaniques des, les types de cellules individuelles ou les tissus sous évaluation²⁴. Alors que l’étude de tissus ou d’organes peut faire la lumière sur la déformation des tissus et des changements morphologiques bruts subies à la suite des événements de souffle, l’analyse au niveau cellulaire peut découvrir transcriptionnelles et épigénétiques changements influencés par l’onde de choc.

Cet article de méthodes décrit une technique pour propager des ondes de choc à une gamme de pressions sur des cellules vivantes dans une monocouche. Cela permet la caractérisation immédiate de la viabilité cellulaire, élucider les seuils de nuisibilité potentielle des ondes de choc. En outre, les cellules viables peuvent être retournés aux conditions de culture standard, et des effets biologiques à long terme de l’événement de souffle peuvent être évaluées. Le protocole ci-dessous décrit deux techniques de viabilité cellulaire qui peuvent être utilisés sur des cellules en culture.

Figure 1 : Rapprochement d’une vague de Friedlander. (A) une approximation d’une vague de Friedlander observée à capteur 3 sur le tube de choc. (B) les données représentatives montrant les profils différents de pression observée à capteurs 1, 2 et 3 sur le tube de choc. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Protocol

1. cellule Culture et préparation des échantillons obtenir une lignée de cellules appropriées (p. ex., cellules de la papille dermique). Remarque : Le protocole actuel a été conçu pour les cellules adhérentes, avec des fibroblastes de papilles dermiques de rats isolés des vibrisses utilisés comme modèle. Culture des cellules dans un ballon T-75 minimales essentiel α moyen de (MEM) additionné de sérum de veau fœtal 10 % et 1 % la pénicilline streptomycine. Garder les cellules dans des conditions de culture standard de 37 ° C et 5 % de CO 2 dans un environnement humidifié avant d’avoir atteint 80 % confluent. Aspirer le milieu et laver les cellules deux fois de Dulbecco ' s tampon phosphate salin (PBS). Dissocier les cellules du flacon en incubant eux dans 2 mL de trypsine/EDTA à culture standard conditions pendant 5 min. brièvement vérifier pour s’assurer que les cellules ont avec succès dissociée du flacon à l’aide d’un microscope à contraste de phase voyant “/” (avec un objectif de 10 X ). Ajouter 4 mL de milieu de culture pour neutraliser la réaction de la trypsinisation. Transférer la suspension de cellules dans un tube à centrifuger 15 mL. Centrifugeuse à 200 x g pendant 4 min granuler les cellules. Lentement, aspirer le surnageant, en prenant soin de ne pas pour déloger la pastille. Resuspendre le culot dans 5 mL de milieu. Transfert d’une quantité de 20 µL de la suspension cellulaire à un hémocytomètre propre et compter les cellules à l’aide d’un microscope muni d’un objectif de 10 X. Préparer les cellules à l’explosion en plaçant trois plats de 35 mm à l’intérieur d’un plat de 90 mm. Les étiqueter correctement. Ajouter 2 mL de milieu à chaque plat de 35 mm et un total de 5 x 10 4 cellules par plat, distribuant les cellules uniformément autour de la capsule de graines. Incuber les échantillons expérimentaux du jour au lendemain dans des conditions de culture standard permettant la fixation des cellules adéquat avant l’exposition de l’onde de choc. Remarque : Pour l’imagerie de fluorescence, les cellules doivent être semées sur lamelles de verre stériles. 2. Ensemble Tube de choc Figure 2 : EVOC Rig et choc Tube Assembly. (A) Image de la plate‑forme EVOC. (B) schéma de l’appareil de tube de choc. Les dimensions de tube choc comprennent un diamètre intérieur de 59 mm et une longueur totale, y compris la plate-forme EVOC, de 4,13 m. La longueur du tube conduit et les totaux de rig EVOC 2,71 m. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Porter des bottes de travail en acier-pieds et un manteau de laboratoire pendant les procédures d’Assemblée. Insérer les barres de deux alignement à travers les trous de deux éclissage trouvent dans le plan horizontal de la bride de sortie. Placer une feuille de joint en caoutchouc nitrile sur l’extrémité des barres alignement afin qu’il se trouve entre la bride de sortie et la plate-forme de la culture (EVOC) ex vivo orgue. Remarque : La plate-forme EVOC est un appareil sur-mesure destiné aux plats de Pétri de 35 mm ( Figure 2 a). Fixer le rig EVOC à la bride de sortie du tube de choc en faisant glisser le luminaire au-dessus des barres de l’alignement, en veillant à ce qu’il est orienté correctement afin que la section qui contient la boîte de Petri est située à sa base. Insérer quatre boulons M24 et rondelles dans les trous restants. Placer les écrous afin qu’ils touchent la bride. Solidement fixer les écrous et boulons séquentiellement de façon symétrique en diagonale tout en vérifiant visuellement que le tube de forage et choc EVOC ont aligné avec succès. Fixer un transducteur de pression au banc d’essai EVOC et connecter à la source de courant à l’aide d’un câble de la sonde. Puis, à l’aide d’un câble BNC, connectez la source de courant à l’oscilloscope. S’assurer que toutes les vannes de sortie et flux de contrôles sur le tube de choc est fermés. Ouvrez la ligne de l’air comprimé externe intégré et tourner manuellement le régulateur de pression dans le sens horaire pour charger le solénoïde à 2,5 bar Ouvrir la soupape de sûreté sur la bouteille de gaz comprimé en le tournant dans le sens anti-horaire 180°. Tourner lentement le régulateur de pression, situé sur le dessus de la bouteille de gaz, dans le sens horaire pour augmenter la pression à environ 15 barre Remarque : Le point de ce régulateur devrait être légèrement au-dessus de la plus haute pression de rupture de la membrane plus épaisse qui doit être utilisé dans l’expérience. Préparer les diaphragmes en coupant une feuille de plastique 0,125 mm d’épaisseur en carrés de 10 x 10 cm. Remarque : L’épaisseur de la membrane fera la corrélation avec la pression d’éclatement, modifier la pression de crête de l’onde de choc (c.-à-d., une membrane plus épaisse se traduira par une onde de choc avec une plus grande pression de crête ; Le tableau 1). < tableau fo:keep-together.within-page = « 1 » > membrane Mylar dimensions (cm) pression (bar) d’éclatement capteur 3 plage de pression (kPa) x 10 x 10 0,023 2 ± 0,2 47 ± 7,5 10 x 10 x 0,050 4 ± 0,2 72 ± 7,5 10 x 10 x 0,125 9,5 ± 0,5 ± 127 12,5 tableau 1 : Burst pression correspondant à l’épaisseur de la membrane et de la pression de crête. créer des poignées hors bande, fixer en haut et en bas du diaphragme, puis utilisez-les pour positionner soigneusement le diaphragme à côté de la petite bride avant de la chambre de la culasse. S’assurer que le diaphragme est droite et correctement positionné avant la fermeture de la culasse. Cela fixer à l’aide de M24 boulons et écrous. Bien fixer les écrous et boulons séquentiellement de façon symétrique en diagonale. 3. Préparation de cellules juste avant l’exposition de l’onde de choc Prepare une hotte à flux laminaire tissu en effectuant la stérilisation ultraviolette. Nettoyez-le avec un désinfectant solution et 70 % d’éthanol. Rassembler tous les éléments nécessaires à la manipulation des cellules préalable à/post-shock wave exposition et placez-les dans la hotte stérile. Remarque : Cela comprend un milieu frais, membranes perméable au gaz adhésifs, ciseaux stériles, pipettes et pipette conseils. Transférer un 90 mm boîte de Pétri contenant trois échantillons expérimentaux de l’incubateur à la hotte stérile. Coupe une membrane perméable au gaz adhésive feuille (voir la Table des matières) en six carrés, telle que chacun est assez grand pour couvrir le dessus d’un plat de Pétri de 35 mm. Aspirer le milieu de la 35 mm boîte de Pétri, placer le couvercle sur le côté et couvrir avec deux sections de l’adhésif membranes perméable au gaz, s’assurer qu’il y a un joint étanche entre la membrane et le bord du plat. Transférer l’échantillon au banc d’essai EVOC et fixez-la à la base de l’appareil afin que le haut du plat est aligné avec la base intérieure du tube choc. 4. Opération de Tube de choc porter les oreilles, lunettes, bottes de sécurité et un manteau de laboratoire pour pressuriser le système de tube de choc. Tourner la manette de réglage du régulateur vers la droite, permettant aux gaz de s’écouler dans le tuyau flexible reliant le cylindre d’air comprimé dans le tube de choc. Au bas du panneau, sélectionnez soit le " culasse Double " inlet pour un choc de courte durée wave ou la " conducteur Tube " inlet pour une durée accrue vague. Mettez la source d’alimentation CC et un oscilloscope pour obtenir les données de forme d’onde. Définissez la fréquence d’échantillonnage oscilloscope à 50,0 MS/s, avec une longueur de 1 M points. Définir une plage de 50 mV pour les tirs à 2 bar et 100 mV pour au-dessus de la barre 4 Allumer les lumières de sécurité à l’aide de l’interrupteur sur le mur en face du panneau de commande. Remarque : Cela indique d’autres chercheurs ne pas d’entrer dans la salle lorsque le tube de choc est en charge. Allumez l’interrupteur sur le boîtier de commande de solénoïde pour fermer le solénoïde. Remarque : Ce dispositif de sécurité ferme une vanne située sur la chambre double culasse, permettant au système d’être facturé. Sur le panneau de configuration, ouvrez lentement le contrôle de flux en tournant le bouton dans le sens anti-horaire pour augmenter progressivement la pression dans la chambre de compression. Contrôler la pression à l’aide de l’affichage du panneau contrôle. Une fois le diaphragme pression d’éclatement est atteint, le diaphragme va entraîner une rupture et une " bang " sera entendu. Fermez rapidement le contrôle de flux en tournant le bouton. Remarque : L’onde de choc se rendra dans le tube sur l’échantillon de cellules et l’extrémité du tube. Ouvrir le solénoïde en tournant l’interrupteur sur le boîtier de commande du solénoïde et éteindre la lumière de sécurité (à l’aide de l’interrupteur sur le mur en face du panneau de commande). Transférer l’échantillon de cellules dans la hotte stérile, retirer la membrane perméable au gaz adhésive et remplissez le plat avec 2 mL de milieu de croissance fraîche. Les cellules peuvent être utilisés immédiatement pour évaluation, tel que décrit à l’étape 5 ou retournées à l’incubateur pour les études à plus long terme. 5. Viabilité cellulaire évaluer la viabilité des cellules après exposition d’onde de choc à l’aide de la combinaison d’un dosage d’indicateur rédox et l’imagerie de fluorescence des cellules vivantes et mortes. NOTE : Pour l’imagerie de fluorescence, les cellules doivent être semées sur couvre-objet en verre stérile au cours de la section 1 : préparation de culture et de l’échantillon de cellules. Ceux-ci peuvent être placés dans les boîtes de Pétri de 35 mm avec. Transférer 200 µL de réactif indicateur rédox (voir la Table des matières) à chaque plat expérimental directement après leur remplissage avec 2 mL de moyenne après choc wave exposition. Incuber à des conditions de culture standard pour 4 h. Pour chaque plat, transfert (sous une hotte stérile foncée) 2 x 100 µL d’extraits d’un noir ou clair plaque à 96 puits, selon si fluorescence ou absorbance servira à évaluer la viabilité. La plaque 96 puits de transfert à un lecteur de plaque approprié monté avec les filtres corrects et lues à l’aide de bandes d’excitation 530ex/590em pour fluorescence ou 570 nm combinés avec une référence de 600 nm d’absorbance. Exporter et enregistrer les données. Analyser les données afin d’identifier toute différence entre les échantillons exposés à l’onde de choc et de témoins non exposés, car cela peut indiquer une goutte d’eau dans la viabilité cellulaire. Remarque : Un témoin négatif devrait également figurer dans le dispositif expérimental. En outre, l’interpolation de courbe d’étalonnage peut être utilisée pour calculer le nombre de cellules. Aspirer le support contenant le réactif d’indicateur rédox. Remplacez-le par 2 mL de milieu frais et incuber les cellules dans les conditions de culture standard pendant 24 h. Répétez les étapes précédentes si nécessaire pour obtenir un deuxième point de temps viabilité. Pour l’imagerie de fluorescence des cellules vivantes et mortes, aspirer le milieu et laver les cellules deux fois dans 1 mL de PBS. Transférer 100 µL de réactif complet trouvé dans l’imagerie nécessaire (voir la Table des matières) pour chaque échantillon et incuber à température ambiante, abrie de la lumière pendant 15 min. Aspirer le réactif et laver une fois à l’aide de 1 mL de PBS. À l’aide de pinces à pointe fine, retirer le plat de 35 mm de la lamelle couvre-objet soigneusement et le placer face vers le bas sur une lame de microscope verre. D’acquérir des images pour chaque échantillon à l’aide d’un microscope à fluorescence (10 X objectif, ouverture numérique 0,50) monté avec les filtres d’excitation et d’émission correctes (ex / em 488 nm/515 nm et 570 nm nm/602). Remarque : Des cellules vivantes émet une fluorescence intense, uniforme, verte. Cellules mortes ou mourantes recouverte d’une membrane cellulaire compromise seront l’absorption du composant de kit morts, ce qui entraîne l’émission de fluorescence rouge, que l’on trouve surtout dans la région nucléaire de la cellule. Utiliser l’analyse d’image logiciel soit manuellement, soit automatiquement compter le nombre de cellules vivantes et mortes de chaque image.

Representative Results

Cultivées dans une monocouche de cellules à l’aide de la méthode décrite ci-dessus, ont été exposés en triple exemplaire à ondes de choc générées à l’aide d’un tube à choc (Figure 2 b). Marqueurs de viabilité cellulaire ont été évalués. À l’aide d’un test d’indicateur rédox, il a été constaté que l’application d’une onde de choc de 127 kPa a pu réduire de manière significative la viabilité des cellules de la papille dermique par rapport aux témoins après 24h de culture (Figure 3). L’application d’une onde de choc ≤72 kPa n’a pas réduit la viabilité. À l’appui de ces observations, un test d’image fluorescente capable de fluorescent étiquetage des cellules vivantes ou mortes avec des fluorophores vertes ou rouges, respectivement, a été utilisé. La quantification des cellules vivantes et mortes de 13 images fluorescentes par réplicat biologique a démontré une réduction de la viabilité cellulaire chez les personnes exposées à l’onde de choc de 127 kPa par rapport au contrôle (Figure 4). L’analyse statistique a été réalisée à l’aide d’une ANOVA à suivie de test de comparaison multiple de Tukey, avec p < 0,05 considérée comme statistiquement significative. La taille de l’échantillon par groupe s’élevaient à 9 pour le dosage d’indicateur rédox et 39 pour l’analyse d’imagerie de fluorescence quantitatives. Figure 3 : Données de test indicateur redox montrant l’évolution temporelle de la viabilité cellulaire après l’onde de choc exposition. Significativement moins de cellules ont été observés après 24 h dans le groupe exposé onde de choc à 127-kPa par rapport à des témoins non traités. Le contrôle négatif qui se composait d’un traitement de 30 s avec 2 % désinfectant (voir la Table des matières) a montré nettement moins de cellules à T0 et 24h par rapport à tous les autres groupes. Chaque barre représente la moyenne ± 1 écart-type (SD) ; réplicats biologiques, N = 3 ; réplique de technique, n = 3. = p < 0,0001. * = p < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Imagerie de fluorescence. (A) les données quantitatives recueillies à partir des images fluorescentes de cellules vivantes et mortes capturées à l’aide d’un microscope à fluorescence à l’exposition d’onde de choc après 24h. Significativement moins de cellules viables ont été observés dans l’armée populaire coréenne 127 (signifie = 93,42) échantillon exposées à l’onde de choc par rapport à l’armée populaire coréenne 47 (signifie = 98.18), 72 kPa (signifie = 98.87) et le groupe témoin (moyenne = 99,10). Aucune des cellules viables ont été observés sur le groupe témoin négatif après 24 h (moyenne = 0). Images de fluorescence représentatif (B). Vert montre des cellules vivantes, tandis que le rouge indique les cellules mortes. Chaque boîte à moustaches montre les quartiles supérieurs et inférieurs avec des moustaches de Tukey ; réplicats biologiques, N = 3 ; réplique de technique, n = 13. = p < 0,0001. Echelle = 300 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Lésions primaires obtenues contre l’exposition à des événements de l’explosion ne sont pas encore bien comprises. Identifier et comprendre les mécanismes qui déclenchent les blessures induite par le souffle, comme traumatisme cérébral lésion³^,⁴ et ossification hétérotopique⁶^,⁷, sont importants premiers pas à l’élaboration méthodes efficaces de la prophylaxie. Pour aider à atteindre cet objectif, un certain nombre de systèmes expérimentaux ont été développé pour répliquer blast événement exposition¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁸^,¹⁹. La technique décrite ici utilise des équipements de tube de choc (Figure 2) capable de tirer des ondes de choc à une gamme de pressions au corps entier (c’est-à-dire, un rongeur), tissu ou échantillons cellulaires. La possibilité de charger les types de cellules individuelles plutôt que des tissus entiers donne la possibilité d’analyser les réponses cellulaires distincts, comme des dommages peuvent survenir en même temps grâce à une gamme de mécanismes¹^,². Par exemple, afin de modéliser le traumatisme crânien, l’évaluation des types de cellules individuelles, comme les neurones et les astrocytes, peut permettre pour l’identification des lésions spécifiques des cellules. Aussi, la réponse de l’ensemble d’organes peut être évaluée à l’aide de tissus cérébraux. Aussi bien les types de cellules individuelles et les échantillons de tissus ont une valeur et peuvent donner des informations différentes. Il est également possible de modifier la quantité d’air qui est sous pression pour générer le choc en sélectionnant l’entrée double-culasse ou le tube conducteur. Ceci détermine la durée de l’onde de choc. Une autre possibilité est de changer le matériau et l’épaisseur de modifier la pression de crête²⁵.

Un autre facteur à considérer sont les effets d’interférence fin qui peuvent être présents lorsque le logement de l’échantillon se trouve près de la sortie du tube choc, telle que celle trouvée sur la plate‑forme EVOC décrite dans le système actuel. Chandra et al. regarda blast wave profils retrouvés à différents endroits sur un tube de choc axée sur la compression et que la forme d’onde Friedlander a été mieux représentée à un endroit profondément dans le tube de choc¹⁵. Ramos et al. également étudié chargement secondaire de l’échantillon et a conclu que la mise en place d’une plaque d’extrémité à l’extrémité du tube de choc était en mesure d’éliminer les ondes réfléchies indésirables¹⁶. Considérant les données trouvées dans ces publications¹⁵^,¹⁶, futures modifications pour améliorer le système de tube de choc décrit dans cet article pourraient impliquer la mise en place de la plate‑forme EVOC à un emplacement plus profondément dans le tube d’entraînement ou, par ailleurs, l’inclusion d’une rondelle d’arrêt sur le tube de choc. Limitations de la méthode décrite pourraient inclure le débit relativement faible des échantillons. Un seul utilisateur peut exploiter le tube de choc en toute sécurité à une production de près de 6-8 échantillons / heure. À l’heure actuelle, le système est conçu autour de l’utilisation de simples plats de Pétri de 35 mm. Des expériences plus grands contenant de multiples groupes et réplicats biologiques peuvent donc s’avérer difficiles à réaliser.

Cet article de méthodes montre comment la viabilité des cellules de la papille dermique adhérentes a été affectée par une exposition à une seule onde de choc. Une onde de choc de courte durée (< 10 ms) du ≤72 kPa n’affecte pas la viabilité par rapport au contrôle (Figure 3 et Figure 4). En revanche, une onde de choc à 127 kPa stimulée par une chute significative de viabilité à post-explosion 24h, comme indiqué par un test d’indicateur rédox (Figure 3) et analyse d’images fluorescentes (Figure 4). Miller et coll. ont signalé une réduction similaire dans la viabilité des cellules dans l’hippocampe organotypiques rat quand les cellules sont exposées à un ou l’autre une 147 kPa ou onde de choc de 278 kPa à l’aide d’un tube de choc à composition non limitée, pilotée par l’hélium¹⁴. En revanche, VandeVord et coll. ont signalé qu’il n’a aucun effet sur la viabilité dans les astrocytes de rats exposés à une surpression de courte durée de > 200 kPa, bien qu’un barochamber a été utilisé au lieu d’un tube de choc¹⁸. Il est à noter que la pression extérieure est tributaire de l’onde de choc, bien que cela crée des ondes complexes stress au sein de l’organisme, entraînant ainsi la nature du chargement très largement sur les propriétés mécaniques des tissus ou cellules. Des études de caractérisation supplémentaire de la réponse cellulaire aux événements de souffle est nécessaire. En outre, par l’évaluation de l’exposition d’onde de choc au niveau cellulaire, comme le montre cette technique, réponses biologiques déclenchées à partir de la blessure, comme la perturbation de la signalisation des voies ou des changements épigénétiques, peuvent être identifiés et explorés davantage.

En conclusion, cet ouvrage décrit l’utilisation d’un tube de choc en acier inoxydable et un mis à jour le gréement EVOC pour intégrer les cultures de cellules primaires. Ondes de choc à une gamme de pressions peut être générés et propagées sur des cellules vivantes pour reproduire les effets qui se produisent d’une exposition à une onde de choc. Ce protocole montre comment évaluer la viabilité des cellules, mais les changements à long terme à des types de cellules individuelles peuvent également être étudiés. Aller plus loin, nous avons l’intention d’évaluer les effets différentiels qui complexe des ondes de choc peut susciter chez différents types de cellules, dans le but de faire progresser notre compréhension des lésions primaires induite par l’explosion.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à souligner l’appui financier de la Royal British Legion Centre pour les études de blessure Blast HA et le financement du Conseil de recherches médicales (M01858X/1) à CAH.

Materials

MEM α, nucleosides	ThermoFisher	22571020
Fetal Bovine Serum, certified, US origin	ThermoFisher	16000044	Supplement to create complete growth media.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15070-063	Supplement to create complete growth media.
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	ThermoFisher	15400-054	Dilute 1 in 10 before use.
CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented	Starlab	CC7682-4875
TC Dish (PS) 35mm, 8.5 cm2	Triple Red	TCD010035
Petri dish (PS) 90×14.2mm no vent	VWR UK	391-0453
Gas Permeable Adhesive Plate Seals	ThermoFisher	AB-0718
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	ThermoFisher	R37601
Alamarblue cell viability reagent	Fisher Scientific	13494309
Virkon tablets	VWR UK	115-0020	Use to create 2% solution as viability control reagent.
Dumont forceps	SurgicalTools	11295-10	Use to remove coverslips from petri dish.
Cover glass, square	VWR UK	631-0125
Microscope slides	VWR UK	631-1553
96 Well plate, solid black	AppletonWoods	CC760	Plate to be used for fluorescence measurements.
96 Well plate, clear, (PS)	VWR UK	734-1799	Plate to be used for absorbance measurments.
Leica DMi1 Camera stand outfit	Leica Microsystems		Optical microscope used for cell culture.
Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton	Zeiss		Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging.
EnVision Multilabel Reader	PerkinElmer	2104-0010A	Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings.
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.023mm	RS Components	785-0782	Use to create shock tube diaphragm.
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.05mm	RS Components	785-0786	Use to creatw shock tube diaphragm.
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.125mm	RS Components	785-0798	Use to create shock tube diaphragm.
Current source power unit	Dytran Intruments Inc.	4103C	Power source for 2300V1 sensor.
IEPE Pressure Sensor	Dytran Intruments Inc.	2300V1	Pressure sensor located on shock tube.
Digital Phosphor Oscilloscope	Tektronix	DPO 4104B	Use to gather and save sensor 2300V1 data.

References

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Logan, N. J., Arora, H., Higgins, C. A. Evaluating Primary Blast Effects In Vitro. J. Vis. Exp. (127), e55618, doi:10.3791/55618 (2017).

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