Evaluating Primary Blast Effects <em>In Vitro</em>

Niall J. Logan; Hari Arora; Claire A. Higgins

doi:10.3791/55618

JoVE Journal > Bioengineering

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Bioengineering

Valutazione primaria Blast effetti In Vitro

Published: September 18, 2017

doi:

10.3791/55618

Niall J. Logan¹, Hari Arora¹, Claire A. Higgins¹

¹Department of Bioengineering,Imperial College London

Summary

Comprendere come le cellule sono modulate dall’esposizione a onde d’urto può aiutare a identificare i meccanismi dietro lesioni attivate da eventi di esplosione. Questo protocollo utilizza attrezzature di tubo su misura shock di applicare onde d’urto in una gamma di pressioni di monostrati di cellule umane e di identificare i conseguenti effetti sulla vitalità cellulare.

Abstract

Esposizione a eventi di esplosione può causare gravi traumi agli organi vitali quali i polmoni, le orecchie e nel cervello. La comprensione dei meccanismi dietro tali lesioni di scoppio-indotta è di grande importanza considerando la recente tendenza verso l’uso di esplosivi in modern warfare e incidenti correlati terrorista. Per comprendere appieno la lesione indotta da scoppio, dobbiamo prima essere in grado di replicare tali eventi esplosione in un ambiente controllato utilizzando un metodo riproducibile. In questa tecnica utilizzando attrezzature tubo shock, onde d’urto in una gamma di pressioni può essere propagate su cellule vive coltivate in 2D, e marcatori di attuabilità delle cellule possono essere analizzati immediatamente utilizzando un dosaggio di indicatore redox e l’imaging fluorescente di cellule vivi e morte. Questo metodo ha dimostrato che aumentando la sovrappressione di scoppio di picco a 127 kPa può stimolare un calo significativo nell’attuabilità delle cellule rispetto ai comandi non trattati. Campioni di prova non sono limitati a cellule aderenti, ma possono includere sospensioni cellulari, corpo intero e campioni di tessuto, attraverso piccole modifiche per l’installazione del tubo di scossa. Replicare le esatte condizioni che tessuti e cellule verificano quando esposti ad un evento di vera esplosione è difficile. Tecniche come quello presentato in questo articolo possono aiutare a definire le soglie di danno e identificare i cambiamenti epigenetici e post-trascrizionali all’interno delle cellule che derivano dall’esposizione a onde d’urto.

Introduction

Con la recente tendenza verso l’uso di dispositivi esplosivi improvvisati in modern warfare e azioni terroristiche contro i civili, comprensione degli effetti di eventi esplosivi sul corpo umano è di grande importanza. Lesioni ottenute attraverso l’esposizione a eventi di esplosione possono essere mortale e letale, con i processi fisici della ferita è diviso in quattro categorie. Risultato di lesioni primarie dall’esposizione diretta all’onda d’urto, che interagisce localmente con il corpo in un modo alla compressione e successivamente espansivo, provocando la rottura delle membrane e dei tessuti molli¹. Lesioni secondarie includono il trauma smussato o penetrative ferite causate dall’impatto con oggetti di bassa massa azionati ad alta velocità dall’onda d’urto. Terziarie lesioni si verificano quando l’onda d’urto ha energia sufficiente per lanciare oggetti di massa elevata o individui contro oggetti. Infine, lesioni da esplosione quaternario sono definite da altre lesioni varie che non rientrano nelle altre categorie, quali burns flash². A seguito dell’esposizione ad eventi di scoppio, lesioni primarie includono cerebrali traumatiche lesioni³^,⁴^,⁵, ossificazione heterotopic⁶^,⁷, esplosione del polmone lesioni⁸, perdita dell’udito ⁹e gli altri¹⁰.

Una forma d’onda comunemente osservata da eventi di scoppio è l’onda di Friedlander, che rappresenta un campo libero, al contrario di uno spazio racchiuso, esplosione. La forma d’onda è costituito da un fronte di scoppio che può essere definito come un forte e rapido aumento della pressione positiva. Questo è immediatamente seguito da un vento di scoppio di aria in movimento ad alta velocità e un’onda di rilascio che riduce la pressione di sotto livelli atmosferici. Un vuoto parziale è lasciato alla regione dell’esplosione iniziale, che provoca il lento ritorno dell’aria. Le fasi positive e negative dell’onda (Figura 1A) causare il movimento di opposizione del blast wave¹. Per contribuire a delucidare i meccanismi dietro lesioni da esplosione primaria, modelli sperimentali sono stati creati per produrre forme d’onda, come l’onda di Friedlander, che cellule e tessuti si troveranno ad affrontare quando esposti all’evento vera esplosione. Gli attuali sistemi elencati nella letteratura includono scossa tubi¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷, barochambers¹⁸^,¹⁹, la Kolsky bar²⁰, blast avanzati simulatori²¹, Split Hopkinson pressione bar²²e la ricreazione di eventi alternativi esplosione in un ambiente controllato utilizzando Tetranitrato di pentaeritrite²³. Nonostante la vasta gamma di modelli disponibili, molte variabili influenzano la ferita ottenuta da onde di esplosione, tra cui lo pre-stress applicato e le proprietà meccaniche del, tipi di singole cellule o tessuti sotto valutazione²⁴. Mentre lo studio di tessuti o organi può gettare luce su deformazione del tessuto ed i cambiamenti morfologici lordi subiti a seguito di eventi di scoppio, analisi al livello cellulare può rivelare i cambiamenti epigenetici e post-trascrizionali, influenzato dall’onda d’urto.

In questo articolo di metodi descrive una tecnica per propagare le onde d’urto in una gamma di pressioni sopra in un monostrato di cellule vive. Questo permette l’immediata caratterizzazione di attuabilità delle cellule, delucidando soglie di danno potenziale da onde d’urto. Inoltre, cellule vitali possono essere restituite a condizioni di coltura standard, e gli effetti biologici a lungo termine dell’evento di esplosione possono essere valutati. Il protocollo qui di seguito vengono descritte due tecniche di attuabilità delle cellule che possono essere utilizzati su cellule in coltura.

Figura 1: Approssimazione di onda Friedlander. (A) un’approssimazione di un’onda di Friedlander osservata al sensore 3 sul tubo di scossa. (B) dati rappresentativi che mostra i profili di pressione differenti osservati a sensori 1, 2 e 3 del tubo di scossa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. coltura delle cellule e preparazione del campione ottenere un’opportuna linea cellulare (ad es., cellule di papilla dermica). Nota: Il protocollo attuale è stato progettato per le celle aderenti, con fibroblasti di papilla dermica del ratto isolati da vibrisse usati come modello. Della coltura le cellule in una bottiglia di T-75 contenente α di medie essenziale minimo (MEM) completati con 10% siero bovino fetale e 1% penicillina streptomicina. Mantenere le cellule in condizioni di coltura standard di 37 ° C e 5% di CO 2 in un ambiente umidificato, fino a quando non raggiungono la confluenza di 80%. Il mezzo di aspirare e lavare le cellule due volte in Dulbecco ' soluzione tampone fosfato (PBS) e s. Dissociare le cellule dalla beuta di incubarle in 2 mL di tripsina/EDTA alle impostazioni cultura standard condizioni per 5 min, brevemente verifica per assicurare che le cellule hanno correttamente dissociato dalla beuta utilizzando un microscopio a contrasto di fase luce (con un obiettivo obiettivo 10x ). Aggiungere 4 mL di terreno di coltura per neutralizzare la reazione di trypsinization. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL. Centrifuga a 200 x g per 4 min agglomerare le cellule. Lentamente e aspirare il supernatante, facendo attenzione a non per staccare il pellet. Risospendere il pellet in 5 mL di terreno. Trasferire un’aliquota di 20 µ l della sospensione delle cellule un emocitometro pulito e contare le celle utilizzando un microscopio dotato di un obiettivo obiettivo 10 X. Preparare le celle per l’esplosione inserendo tre piatti di 35 mm all’interno di un piatto di 90 mm. Etichettarli in modo appropriato. Aggiungere 2 mL di terreno ad ogni piatto di 35mm e un totale di 5 x 10 4 celle per ogni piatto, distribuire le cellule in modo uniforme intorno al piatto del seme. Incubare i campioni sperimentali durante la notte in condizioni di coltura standard per consentire per adesione cellulare adeguata prima dell’esposizione Ondashock. Nota: Per l’imaging di fluorescenza, le cellule devono essere seminate su lamelle di vetro sterile. 2. Assemblea di tubo di scossa Figura 2 : EVOC Rig e Shock Tube Assembly. (A) immagine del rig EVOC. (B) disegno schematico dell’apparato del tubo di scossa. Dimensioni del tubo di scossa includono un diametro interno di 59 mm e una lunghezza totale, compreso l’impianto di perforazione EVOC, 4,13 m. La lunghezza del tubo guidato e i totali di rig EVOC 2,71 m. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Indossare stivali da lavoro in acciaio-punta e un camice da laboratorio durante le procedure di montaggio. Inserto delle due barre attraverso i due fori trovano sul piano orizzontale della flangia presa. Posizionare un foglio di guarnizione di gomma nitrilica sopra l’estremità delle barre di allineamento in modo che si trova tra la flangia di uscita e il rig ex vivo organo cultura (EVOC). Nota: L’impianto di perforazione EVOC è un apparecchio di misura destinato all’uso con 35 mm di Petri ( Figura 2A). Collegare l’impianto di perforazione EVOC per la flangia di uscita del tubo di scossa facendo scorrere il fissaggio delle barre, assicurando che sia orientato correttamente affinché la sezione che contiene la capsula di Petri si trova alla sua base. Inserire i fori rimanenti quattro bulloni M24 e rondelle. Posizionare i dadi in modo che tocchino la flangia. Fissare saldamente i dadi e bulloni in sequenza in modo diagonale simmetrico mentre controllando visivamente che il tubo di rig e scossa EVOC sono correttamente allineati. Allegare un trasduttore di pressione per l’impianto di perforazione EVOC e collegarlo all’origine corrente utilizzando un cavo sensore. Quindi, utilizzando un cavo BNC, collegare la sorgente di corrente all’oscilloscopio. Assicurarsi che tutte le valvole di rilascio e controlli del tubo di scossa di flusso sono chiusi. Aprire la linea di aria compressa esterna incorporata e girare manualmente il regolatore di pressione in senso orario per caricare il solenoide a 2,5 bar Aprire la valvola di sicurezza sulla bombola del gas compresso ruotandolo in senso antiorario 180°. Girare lentamente il regolatore di pressione, situato sulla cima di bombola del gas, in senso orario per aumentare la pressione di circa 15 bar Nota: Il punto di impostazione di questo regolatore dovrebbe essere leggermente sopra il più alta pressione di scoppio del diaframma più spesso che deve essere utilizzato nell’esperimento. Preparare i diaframmi tagliando un foglio di plastica di spessore mm 0,125 in quadrati di 10 cm x 10 cm. Nota: Lo spessore del diaframma mette in correlazione con la pressione di scoppio, alterando la pressione di picco dell’onda d’urto (cioè, un diaframma più spesso si tradurrà in un’onda d’urto con una più grande pressione di picco; Tabella 1). < tavolo fo:keep-together.within-pagina = "1" > diaframma Mylar dimensioni (cm) pressione (bar) di scoppio Sensor 3 range di pressione (kPa) x 10 x 10 0,023 2 ± 0,2 47 ± 7,5 10 x 10 x 0.050 4 ± 0.2 72 ± 7,5 10 x 10 x 0.125 9,5 ± 0,5 127 ± 12.5 tabella 1: Burst pressione corrispondente allo spessore del diaframma e picco di pressione. creare maniglie dal nastro, fissano gli stessi alla parte superiore e inferiore del diaframma e utilizzarli per posizionare con attenzione il diaframma accanto alla piccola flangia anteriore dall’alloggiamento della culatta. Assicurarsi che il diaframma è dritto e il corretto posizionamento prima di chiusura dell’otturatore. Questo fissare con quattro bulloni M24 e dadi. Fissare saldamente i dadi e bulloni in sequenza in modo diagonale simmetrico. 3. Preparazione di cellule appena prima dell’esposizione alle onde di Shock preparare una cappa a flusso laminare tessuto eseguendo sterilizzazione a raggi ultravioletti. Pulirlo con un disinfettante soluzione e 70% di etanolo. Raccogliere tutti gli elementi necessari per manipolazione cellule preventiva per/post-shock wave esposizione e inserirli all’interno della cappa sterile. Nota: Questo include mezzo fresco, adesive membrane permeabili al gas, forbici sterili, le pipette e pipetta suggerimenti. Trasferire un piatto di Petri di 90 mm contenente tre campioni sperimentali dall’incubatrice alla cappa sterile. Taglio una membrana permeabile al gas adesiva foglio (Vedi la Tabella materiali) in sei quadrati, tale che ognuno è grande abbastanza per coprire la parte superiore di una piastra di Petri di 35 mm. Aspirare il mezzo da 35 mm di Petri, mettere il coperchio su un lato e coprire con due sezioni di adesivo membrane permeabili al gas, assicurando che ci sia una perfetta tenuta tra la membrana e il bordo del piatto. Trasferire il campione per l’impianto di perforazione EVOC e fissarlo alla base dell’apparecchio in modo che la parte superiore del piatto è allineata la base interna del tubo di scossa. 4. Funzionamento del tubo di scossa indossare cuffie antirumore, occhiali, stivali di sicurezza e un camice da laboratorio quando pressurizzando il sistema del tubo di scossa. Ruotare la manopola di controllo del flusso del regolatore in senso orario, consentendo di gas di fluire nel tubo flessibile collegare la bombola di aria compressa per il tubo d’urto. Nella parte inferiore del pannello di controllo, selezionare il " doppia culatta " ingresso per un wav di scossa di breve duratae o il " Driver tubo " ingresso per una durata maggiore onda. Interruttore sulla fonte di alimentazione CC e oscilloscopio per acquisire i dati di forma d’onda. Impostare la frequenza di campionamento di oscilloscopio a 50,0 MS/s, con record di lunghezza di 1 M punti. Impostare un intervallo di 50 mV per la cottura a 2 bar e 100 mV per sopra 4 bar Accendere le luci di sicurezza utilizzando l’interruttore sulla parete di fronte il pannello di controllo. Nota: Questo dice di non entrare nella stanza quando il tubo d’urto è in carica, altri ricercatori. Accendere l’interruttore sulla casella di controllo solenoide per chiudere l’elettrovalvola. Nota: Questa funzionalità di sicurezza chiude una valvola posta sulla camera doppia culatta, permettendo al sistema per l’addebito. Il pannello di controllo, aprire lentamente il controllo di flusso, ruotando la manopola in senso antiorario per aumentare gradualmente la pressione all’interno della camera di compressione. Monitorare la pressione utilizzando il display del pannello di controllo. Una volta che il diaframma pressione di scoppio è raggiunto, rompe il diaframma e un " bang " si sentirà. Chiudere rapidamente il controllo di flusso, ruotando la manopola. Nota: L’onda d’urto si recherà giù per il tubo sopra il campione di cellule e fuori l’estremità del tubo. Aprire il solenoide disattivando l’interruttore sulla casella di controllo solenoide e spegnere la luce di sicurezza (utilizzando l’interruttore sulla parete di fronte il pannello di controllo). Trasferire il campione di cellule per la cappa sterile, rimuovere l’adesive membrane permeabili al gas e riempire il piatto con 2 mL di terreno di coltura fresco. Le celle possono essere utilizzate immediatamente per la valutazione, come descritto nel passaggio 5, o restituite nell’incubatore per studi a più lungo termine. 5. Vitalità cellulare valutare la vitalità cellulare dopo l’esposizione di onde d’urto utilizzando la combinazione di un saggio di indicatore redox e l’imaging fluorescente di vivi e morte cellule. Nota: Per l’imaging di fluorescenza, le cellule devono essere seminate su lamelle di vetro sterile durante la sezione 1: cultura e preparazione di campioni di cella. Questi può essere posizionati all’interno le capsule di Petri 35 mm. Trasferire 200 µ l del reagente indicatore redox (Vedi la Tabella materiali) a ogni piatto sperimentale direttamente dopo il loro riempimento con 2 mL di post-shock media onda dell’esposizione. Incubare a condizioni di coltura standard per 4 h. Per ogni piatto, trasferire (in un cappuccio scuro sterile) aliquote di 2 x 100 µ l per entrambi un nero o deselezionare piastra a 96 pozzetti, a seconda se la fluorescenza o assorbanza verrà utilizzato per valutare la fattibilità. Trasferire la piastra a 96 pozzetti per un lettore di piastra appropriato con i filtri corretti e leggere con eccitazione bande 530ex/590em per fluorescenza o 570 nm combinata con un riferimento di 600 nm per assorbanza. Esportare e salvare i dati. Analizzare i dati per identificare eventuali differenze tra onde d’urto-esposti campioni e controlli non esposto, poiché questo può indicare un calo nell’attuabilità delle cellule. Nota: Un controllo negativo deve essere inclusi anche nel disegno sperimentale. Inoltre, l’interpolazione di una curva standard può essere utilizzato per calcolare i numeri di cell. Aspirare il supporto contenente il reagente di indicatore redox. Sostituirlo con 2 mL di terreno nuovo e incubare le cellule in condizioni di coltura standard per 24 h. Ripetere i passaggi precedenti come necessario ottenere un secondo punto di tempo di attuabilità. Per l’imaging di fluorescenza delle cellule vivi e morte, il mezzo di aspirare e lavare le cellule due volte in 1 mL di PBS. Trasferire 100 µ l del reagente completo trovato nell’imaging kit (vedere la Tabella materiali) per ogni campione e incubare a temperatura ambiente al riparo dalla luce per 15 min. Il reagente di aspirare e lavare una volta con 1 mL di PBS. Usando pinze a punta fine, attentamente rimuovere il vetrino coprioggetto dal piatto di 35 mm e metterlo a faccia in giù su un vetrino di microscopia. Acquisire immagini per ciascun campione utilizzando un microscopio a fluorescenza (obiettivo obiettivo 10x, 0.50 apertura numerica) montato con i filtri di eccitazione e di emissione corretti (ex / em 488 nm/515 nm e 570 nm nm/602). Nota: Cellule vive emette fluorescenza intensa, uniforme, verde. Cellule morte o morenti con una membrana cellulare compromessa saranno l’assorbimento il componente kit morto, con conseguente emissione di fluorescenza rossa, trovati principalmente nella regione nucleare della cellula. Utilizzare l’analisi di immagine software per sia manualmente o automaticamente contare il numero di cellule vivi e morti da ogni immagine.

Representative Results

Utilizzando il metodo sopra descritto, cresciute in un monostrato di cellule sono state esposte in triplice copia a onde d’urto generate utilizzando un tubo d’urto (Figura 2B). Marcatori di attuabilità delle cellule sono stati valutati. Usando un’analisi di indicatore redox, è stato trovato che l’applicazione di un’onda d’urto di 127 kPa era in grado di ridurre significativamente l’attuabilità delle cellule di papilla dermica rispetto ai controlli dopo 24 h nella cultura (Figura 3). L’applicazione di un onda d’urto ≤72 kPa non ha ridotto la redditività. Per supportare queste osservazioni, un’analisi di immagine fluorescente capace di fluorescente etichettatura vivi o morte cellule con fluorofori verde o rosso, rispettivamente, è stata usata. La quantificazione delle cellule vivi e morte da 13 immagini fluorescenti per replica biologico hanno dimostrato una riduzione nell’attuabilità delle cellule in quelle esposte per l’onda d’urto 127 kPa rispetto al controllo (Figura 4). L’analisi statistica è stata effettuata utilizzando un one-way ANOVA seguita da test di confronto più di Tukey, con p < 0.05 considerato statisticamente significativo. La dimensione del campione per ogni gruppo è pari a 9 per il dosaggio di indicatore redox e 39 per l’analisi di formazione immagine di fluorescenza quantitativa. Figura 3 : Redox indicatore analisi dati risultati corso di tempo della vitalità cellulare dopo l’esposizione Ondashock. Significativamente meno cellule sono state osservate dopo 24 h del gruppo di onda d’urto-esposti 127-kPa rispetto al controllo non trattato. Il controllo negativo che consisteva in un trattamento di 30-s con 2% disinfettante (Vedi la tabella materiali) hanno mostrato significativamente meno cellule sia T0 e 24h rispetto a tutti gli altri gruppi. Ogni barra rappresenta la deviazione standard media ± 1 (SD); replicati biologici, N = 3; tecnico viene replicato, n = 3. = p < 0,0001. * = p < 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4 : Fluorescenza. (A) dati quantitativi raccolti dalle immagini fluorescenti delle cellule vivi e morte, acquisite utilizzando un microscopio a fluorescenza all’esposizione di onda post-d’urto 24 h. Significativamente meno cellule vitali sono state osservate nel 127 kPa (dire = 93.42) campione di onda d’urto-esposti rispetto ai 47 kPa (significa = 98.18), 72 kPa (significa = 98.87) e gruppi di controllo (significa = 99,10). Nessun cellule vitali sono state osservate nel gruppo di controllo negativo dopo 24 h (media = 0). Immagini di fluorescenza rappresentativo di (B). Verde Mostra cellule vive, mentre il rosso indica le cellule morte. Ogni box-plot Mostra i quartili superiori ed inferiori con whiskers di Tukey; replicati biologici, N = 3; tecnico viene replicato, n = 13. = p < 0,0001. Barra della scala = 300 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Lesioni primarie ottenute dall’esposizione agli eventi esplosione ancora completamente non sono capite. Identificare e comprendere i meccanismi che si innescano lesioni blast-indotta, come di lesioni cerebrali traumatiche³^,⁴ e ossificazione heterotopic⁶^,⁷, sono passi importanti per lo sviluppo metodi efficaci di profilassi. Per raggiungere questo obiettivo, un numero di sistemi sperimentali è stato sviluppato per replicare blast evento esposizione¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁸^,¹⁹. La tecnica descritta qui utilizza attrezzature di tubo di shock (Figura 2) in grado di sparare onde d’urto in una gamma di pressioni al corpo intero (cioè, roditore), tessuto o campioni di cellule. La possibilità di caricare tipi di cellule individuali piuttosto che interi tessuti dà la possibilità di analizzare le risposte cellulari distinte, come danni possono verificarsi contemporaneamente tramite una serie di meccanismi¹^,². Ad esempio, per modellare traumatico cranico, la valutazione di singoli tipi di cellule, quali i neuroni ed astrociti, può consentire per l’identificazione di lesioni di cellula-specifico. Inoltre, la risposta di tutto-organo può essere valutata utilizzando il tessuto cerebrale. Entrambi i tipi di cellule individuali e gli esemplari del tessuto hanno valore e possono dare informazioni diverse. È anche possibile modificare la quantità di aria che è pressurizzato per generare lo shock selezionando l’ingresso doppio-culatta o driver-tubo. Questo controlla la durata dell’onda d’urto. Un’altra possibilità consiste nel modificare il materiale della membrana e lo spessore di alterare la pressione di picco²⁵.

Un altro fattore da considerare sono gli effetti di fine di interferenza che possono essere presenti quando l’alloggiamento del campione si trova vicino all’uscita del tubo di scossa, come quello trovato su rig EVOC descritto nel sistema attuale. Corbetta et al. visto anche blast wave profili trovati su posizioni diverse su un tubo di compressione-driven shock e trovato che la forma d’onda di Friedlander meglio è stata rappresentata in una posizione profonda nell’urto tubo¹⁵. Kuriakose et al. anche studiato secondaria caricamento del campione e trovato che il posizionamento di una piastra terminale all’estremità del tubo di scossa è stato in grado di eliminare le onde riflesse indesiderate¹⁶. Considerando i dati trovati in queste pubblicazioni¹⁵^,¹⁶, future modifiche per migliorare il sistema del tubo di scossa descritto in questo articolo potrebbero coinvolgere il posizionamento dell’impianto di perforazione EVOC in una posizione più profonda all’interno del tubo guidato o, in alternativa, l’inclusione di una piastra di estremità del tubo di scossa. Limitazioni del metodo descritto potrebbero includere la relativamente bassa velocità di trasmissione dei campioni. Un singolo utente può utilizzare il tubo di scossa in piena sicurezza ad una produzione di circa 6-8 campioni / ora. Allo stato attuale, il sistema è stato progettato intorno all’uso singola 35 mm piastre Petri. Pertanto, gli esperimenti più grandi che contengono più gruppi e replicati biologici possono essere difficili da raggiungere.

Questo articolo di metodi viene illustrato come la vitalità delle cellule della papilla dermica aderente è stata influenzata dall’esposizione a una singola onda d’urto. Un’onda di scossa di breve durata (< 10 ms) di ≤72 kPa non ha influenzato la redditività rispetto al controllo (Figura 3 e Figura 4). Al contrario, un’onda d’urto a 127 kPa ha stimolato un calo significativo nell’attuabilità a post-spasso 24h, come mostrato da un saggio di indicatore redox (Figura 3) e l’analisi delle immagini fluorescenti (Figura 4). Miller et al ha segnalato una riduzione simile nell’attuabilità delle cellule nelle colture hippocampal fetta di ratto organotipiche quando le cellule sono state esposte a un uno una 147 kPa o 278 kPa shock wave utilizzando un open-ended, Elio-driven shock tubo¹⁴. Al contrario, VandeVord et al ha segnalato che non c’era alcun effetto sulla vitalità negli astrociti di ratto esposti ad una sovrapressione di breve durata di > 200 kPa, anche se una camera di decompressione è stato usato piuttosto che una scossa tubo¹⁸. Dovrebbe essere notato che la pressione esterna si affida all’onda d’urto, anche se questo crea onde stress complesso all’interno del corpo, rendendo quindi la natura del carico altamente dipendono le proprietà meccaniche dei tessuti o delle cellule. Studi di ulteriore caratterizzazione della risposta cellulare agli eventi di esplosione è necessaria. Inoltre, di valutare l’esposizione di onda d’urto a livello cellulare, come mostrato in questa tecnica, risposte biologiche innescate dal pregiudizio, come ad esempio la perturbazione della segnalazione vie o i cambiamenti epigenetici, possono essere identificate e ulteriormente esplorate.

In conclusione, questo lavoro viene descritto l’utilizzo di un tubo di acciaio inox scossa e un rig EVOC modificato per incorporare colture cellulari primarie. Onde d’urto in una gamma di pressioni può essere generate e propagate su cellule vive per replicare gli effetti che si verificano da esposizione a un’onda d’urto. Questo protocollo viene illustrato come valutare la vitalità cellulare, ma anche possono essere studiate più a lungo termine modifiche ai tipi di cella singola. Andando avanti, ci proponiamo di valutare gli effetti differenziali che complesse onde d’urto può suscitare in diversi tipi cellulari, con l’obiettivo di favorire la nostra comprensione delle lesioni primarie blast-indotta.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo riconoscere il sostegno finanziario del Royal British Legion centro per gli studi di lesione Blast HA e finanziamenti dal Medical Research Council (M01858X/1) di CAH.

Materials

MEM α, nucleosides	ThermoFisher	22571020
Fetal Bovine Serum, certified, US origin	ThermoFisher	16000044	Supplement to create complete growth media.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15070-063	Supplement to create complete growth media.
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	ThermoFisher	15400-054	Dilute 1 in 10 before use.
CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented	Starlab	CC7682-4875
TC Dish (PS) 35mm, 8.5 cm2	Triple Red	TCD010035
Petri dish (PS) 90×14.2mm no vent	VWR UK	391-0453
Gas Permeable Adhesive Plate Seals	ThermoFisher	AB-0718
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	ThermoFisher	R37601
Alamarblue cell viability reagent	Fisher Scientific	13494309
Virkon tablets	VWR UK	115-0020	Use to create 2% solution as viability control reagent.
Dumont forceps	SurgicalTools	11295-10	Use to remove coverslips from petri dish.
Cover glass, square	VWR UK	631-0125
Microscope slides	VWR UK	631-1553
96 Well plate, solid black	AppletonWoods	CC760	Plate to be used for fluorescence measurements.
96 Well plate, clear, (PS)	VWR UK	734-1799	Plate to be used for absorbance measurments.
Leica DMi1 Camera stand outfit	Leica Microsystems		Optical microscope used for cell culture.
Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton	Zeiss		Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging.
EnVision Multilabel Reader	PerkinElmer	2104-0010A	Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings.
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.023mm	RS Components	785-0782	Use to create shock tube diaphragm.
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.05mm	RS Components	785-0786	Use to creatw shock tube diaphragm.
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.125mm	RS Components	785-0798	Use to create shock tube diaphragm.
Current source power unit	Dytran Intruments Inc.	4103C	Power source for 2300V1 sensor.
IEPE Pressure Sensor	Dytran Intruments Inc.	2300V1	Pressure sensor located on shock tube.
Digital Phosphor Oscilloscope	Tektronix	DPO 4104B	Use to gather and save sensor 2300V1 data.

References

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Logan, N. J., Arora, H., Higgins, C. A. Evaluating Primary Blast Effects In Vitro. J. Vis. Exp. (127), e55618, doi:10.3791/55618 (2017).

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