Beoordelende primaire Blast effecten In Vitro

1. celkweek en bereiding van de monsters verkrijgen een geschikte cellijn (bijvoorbeeld dermale papilla cellen). Opmerking: Het huidige protocol is ontworpen voor Adherente cellen, met rat dermale papilla fibroblasten van snorharen gebruikt als een model dat werd geïsoleerd. Cultuur de cellen in een T-75 kolf met minimale essentiële middellange (MEM) α aangevuld met foetale runderserum van 10% en 1% penicilline streptomycine. De cellen op standaard kweekomstandigheden van 37 ° C en 5% CO 2 in een bevochtigde omgeving houden totdat ze 80% samenvloeiing. Het medium gecombineerd en wassen van de cellen tweemaal in Dulbecco ' s-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Distantiëren van de cellen van de kolf door ze aan het broeden in 2 mL trypsine/EDTA op standaard cultuur voorwaarden voor 5 min. kort controleren om ervoor te zorgen dat de cellen met succes hebben losgekoppeld van de kolf met behulp van een licht/fasecontrastmicroscoop (met een 10 X-objectief ). Voeg 4 mL gestolde voedingsbodem te neutraliseren de trypsinebehandeling reactie. De celsuspensie overbrengen in een centrifugebuis 15 mL. Centrifuge op 200 x g voor 4 min aan de pellet van de cellen. Langzaam gecombineerd de bovendrijvende substantie, niet te verjagen van de pellet verzorgen. Resuspendeer de pellet in medium 5 mL. Een hoeveelheid van 20 µL van de celsuspensie overbrengen in een schoon hemocytometer en met behulp van een microscoop voorzien van een 10 X-objectief cellen tellen. Bereiden de cellen voor de ontploffing door het plaatsen van drie 35 mm gerechten binnen een 90 mm schotel. Label hen op de juiste manier. Voeg 2 mL medium aan elk gerecht 35 mm en zaad van een totaal van 5 x 10 4 cellen per schotel, verspreiden de cellen gelijkmatig rond de schotel. Incubeer de experimentele monsters overnachting in standaard kweekomstandigheden te voorzien in adequate cel bijlage vóór de blootstelling van de schokgolf. Opmerking: Voor fluorescerende imaging, cellen moeten worden overgeënt op steriele glazen coverslips. 2. Schok binnenband Figuur 2 : EVOC Rig en Shock Tube vergadering. (A) afbeelding van de EVOC tuig. (B) Schematische voorstelling van de schok buis apparatuur. Schok buis dimensies bevatten een inwendige diameter van 59 mm en een totale lengte, met inbegrip van de EVOC tuig, 4.13 m. De lengte van de gedreven buis en de EVOC tuig totalen 2.71 m. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Staal-teen werk laarzen en een laboratorium jas dragen tijdens de vergadering procedures. Invoegen de bars van de twee uitlijning door middel van de twee bout gaten gevonden in het horizontale vlak van de uitlaat flens. Plaats een nitril-rubber pakking vel op het eind van de balken uitlijning zodat het zit tussen de uitlaat flens en de ex vivo-rig van het orgel-cultuur (EVOC). Opmerking: De EVOC rig is een douane-ontworpen meubilair bedoeld voor gebruik met 35 mm petrischalen ( figuur 2A). De EVOC rig hechten aan de uitlaat flens van de schok-buis door te schuiven van het armatuur over de uitlijning balken, ervoor te zorgen dat het georiënteerde correct zodat de sectie die in het bezit van de petrischaal gelegen aan de voet is. Vier M24 bouten en sluitringen invoegen in de resterende gaten. Plaats de noten zodat ze de flens raken. Strak Fast de moeren en bouten opeenvolgend in een diagonaal symmetrische mode terwijl visueel controleren dat de EVOC rig en schok-buis met succes hebt uitgelijnd. Een drukopnemer hechten aan de EVOC tuig en sluit deze aan op de stroombron met behulp van een sensor kabel. Via een BNC-kabel, sluit vervolgens de huidige bron aan de oscilloscoop. Zorg ervoor dat alle kleppen vrijlaat en controles op de schok buis stromen zijn gesloten. Open de ingebouwde externe persluchtleiding en handmatig Draai de drukregelaar met de klok mee in rekening te brengen van de spoel aan 2,5 bar. Openen van de klep van de veiligheid op de fles met samengeperst gas door tegenwijzerzin 180° draaien. Draaien langzaam de drukregelaar, gelegen op de top van de gasfles, met de klok mee te verhogen de druk ongeveer 15 bar. Opmerking: Het punt van de instelling van deze regulator moet worden iets boven de hoogste barstdruk van de dikste middenrif die moet worden gebruikt in de experiment. Bereiden het pessarium door het snijden van een 0,125 mm dik plastic vel in vierkanten van 10 x 10 cm. Opmerking: De dikte van het membraan zal correleren met de barst druk, verandering van de druk van de piek van de schokgolf (dat wil zeggen, een dikkere diafragma in een schokgolf met een grotere druk van de piek resulteren zal; Tabel 1). Mylar diafragma afmetingen (cm) barsten druk (bar) Sensor 3 drukbereik (kPa) 10 x 10 x 0.023 2 ± 0,2 47 ± 7,5 10 x 10 x 0.050 4 ± 0,2 72 ± 7,5 10 x 10 x 0,125 9,5 ± 0,5 127 ± 12,5 tabel 1: Burst druk die overeenkomt met diafragma dikte en piek druk. grepen uit tape maken, corrigeren naar de boven- en onderkant van het middenrif, en ze gebruiken om het middenrif naast de voorste kleine flens plaats door de stuitligging kamer. Zorgen dat het middenrif rechte en correct gepositioneerd is vóór het sluiten van de stuitligging. Beveiligen dit met behulp van vier M24 bouten en moeren. Strak Fast de moeren en bouten opeenvolgend in een diagonaal symmetrische mode. 3. Voorbereiding van cellen alleen voorafgaand aan de blootstelling van de schokgolf voorbereiden een weefsel laminaire flow hood door ultraviolet sterilisatie uit te voeren. Schoon te maken met een desinfecterende oplossing en 70% ethanol. Verzamelen van alle items die nodig zijn voor behandeling voorafgaande aan/na-shock cellen wave blootstelling en plaats ze binnen de steriele kap. Opmerking: Dit omvat verse medium, zelfklevende gas-permeabele membranen, steriele schaar, pipetten en Pipetteer tips. Overbrengen van een 90 mm petrischaal met drie experimentele monsters uit de incubator aan de steriele kap. Knippen een zelfklevende gas-permeabel membraan sheet (Zie de Tabel van materialen) in zes vierkanten, zodanig dat elk groot genoeg ter dekking van de bovenkant van een 35 mm petrischaal. Het medium van de 35 mm petrischaal gecombineerd, plaats het deksel aan de ene kant, en bedek met twee zelfklevende gas-permeabele membranen secties, ervoor te zorgen dat er een goede afdichting tussen het membraan en de rand van de schotel is. Overbrengen van het monster naar de EVOC tuig en veilig aan de basis van het armatuur zodat de bovenkant van de schotel is uitgelijnd met de innerlijke base van de schok buis. 4. Schok buis operatie verdedigers van oor, oog bril, Veiligheidslaarzen en een laboratorium jas dragen wanneer de schok buis systeem Drukbehandeling. Inschakelen de bedieningsknop van de stroom de regelgever met de klok mee, waardoor gas naar stroom in de flexibele slang de perslucht cilinder verbinden met de schok buis. Aan de onderkant van het control panel, selecteer het " dubbele staartstuk " inlaat voor een korte duur schok wave of de " Driver buis " inlaat voor de duur van een grotere golf. Zet de DC voedingsbron en oscilloscoop om de golfvorm gegevens te vergaren. De oscilloscoop samplingfrequentie ingesteld op 50.0 MS/s, met een record lengte van 1 M punten. Een reeks van 50 mV voor ontslag bij 2 bar en 100 mV voor boven de 4 bar Zet de lichten van de veiligheid met behulp van de schakelaar op de muur tegenover het control panel. Opmerking: Dit vertelt andere onderzoekers niet om de kamer wanneer de buis van de schok wordt opgeladen. Zet de schakelaar op de solenoïde control box te sluiten de solenoïde. Opmerking: Deze veiligheidsfunctie sluit een klep bevindt zich op de dubbele stuitligging kamer, waardoor het systeem ten laste. Op het bedieningspaneel, opent langzaam de datatransportbesturing door te draaien aan de knop tegen de klok in daarna langzaam verhoogt de druk in de zaal van de compressie. Controleren van de druk met behulp van de controle-panelbeeldscherm. Zodra het middenrif druk barsten is bereikt, het middenrif zal scheuren en een " bang " zal worden gehoord. Snel de datatransportbesturing door te draaien aan de knop sluiten. Opmerking: De schokgolf zal reizen vaststelling van de buis over de cel-monster en uit het uiteinde van de buis. De solenoïde door het uitschakelen van de schakelaar op de solenoïde control box openen en schakelen het Veiligheidslicht (met behulp van de schakelaar op de muur tegenover het control panel). Overbrengen van het monster van de cel naar de steriele kap, verwijderen van de lijm gas-permeabele membranen en vul de schotel met 2 mL verse groeimedium. De cellen kunnen worden onmiddellijk gebruikt voor beoordeling, zoals beschreven in stap 5, of keerde terug naar de incubator voor langere termijn studies. 5. Levensvatbaarheid van cellen beoordelen de levensvatbaarheid van de cellen na de schokgolf blootstelling met behulp van de combinatie van een redox indicator assay en de fluorescerende beeldvorming van levende en dode cellen. Opmerking: Voor fluorescerende imaging, cellen moeten worden overgeënt op steriele glazen coverslips tijdens deel 1: cel van cultuur en sample voorbereiding. Deze kunnen worden geplaatst binnen de petrischaaltjes 35-mm. Transfer 200 µL van het reagens redox indicator (Zie de Tabel van materialen) aan iedere experimentele schotel direct na het bijvullen van hen met 2 mL middellange post schok wave blootstelling. Incubeer bij standaard kweekomstandigheden voor 4 h. Overbrengen (in een donkere steriele kap) 2 x 100 µL aliquots ofwel een zwarte of wissen van 96-wells-plaat, afhankelijk van of fluorescentie- of absorptie worden gebruikt voor het beoordelen van de levensvatbaarheid voor elk gerecht,. Overbrengen van de 96-wells-plaat naar een passende afleesapparaat uitgerust met de juiste filters en gelezen met behulp van excitatie bands 530ex/590em voor fluorescentie- of 570 nm gecombineerd met een verwijzing van de 600-nm voor absorptie. Exporteren en opslaan van de gegevens. Analyseren van de gegevens ter identificatie van eventuele verschillen tussen monsters schokgolf-blootgesteld en niet zichtbare besturingselementen, zoals dit op een daling in de levensvatbaarheid van de cellen duiden kan. Opmerking: Een negatieve controle moet ook worden opgenomen in de proefopzet. Anderzijds de interpolatie van een standaard curve kan worden gebruikt voor het berekenen van de cel getallen. Gecombineerd het medium met de redox indicator reagens. 2 mL verse voedingsbodem te vervangen en Incubeer de cellen bij standaard kweekomstandigheden voor 24 h. Herhaal de bovenstaande stappen als nodig is om het verkrijgen van een tweede tijdstip van levensvatbaarheid. Voor de fluorescerende beeldvorming van levende en dode cellen, gecombineerd het medium en wassen van de cellen tweemaal in 1 mL PBS. Breng 100 µL van het volledige reagens gevonden in de beeldvorming kit (Zie de Tabel van materialen) aan elk monster en Incubeer bij kamertemperatuur beschermd tegen licht voor 15 min. Gecombineerd het reagens en wassen zodra met behulp van 1 mL PBS. Met fijne punt pincet, verwijder voorzichtig het dekglaasje aan van de 35 mm-schotel en plaats deze face down op een glasplaatje microscopie. Ophaal beelden voor elk monster met behulp van een fluorescente microscoop (10 X objectief, 0,50 numerieke diafragma) uitgerust met de juiste filters voor excitatie en emissie (ex / em 488 nm/515 nm en 570 nm/602 nm). Opmerking: De levende cellen zal intens, uniform, groene fluorescentie uitstoten. Dood of stervende cellen met een gecompromitteerde cellulaire membraan zal opname de dode kit component, wat resulteert in de uitstoot van rode fluorescentie, voornamelijk in de nucleaire regio van de cel gevonden. Gebruiken beeldanalyse software om ofwel handmatig of automatisch het aantal levende en dode cellen van elke afbeelding.