評価プライマリ ブラスト効果の in Vitro

1 細胞培養そしてサンプル準備 取得適切なセルライン (例えば、 毛乳頭細胞)。 。 注: 現在のプロトコル搭載されており付着細胞のラット乳頭線維芽細胞由来のヒゲのモデルとして使用します。 10% 牛胎児血清と 1% ペニシリン ストレプトマイシン補われる最小必須培地 (MEM) α を含む T-75 フラスコの細胞を培養します。80% の合流点に到達するまで加湿環境で CO 2 を 37 ° C および 5% の標準的な培養条件で細胞を維持します。 培地を吸引・ ダルベッコの 2 回セルを洗浄 ' s リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)。2 mL のトリプシン/edta 標準文化 5 分のための条件は簡単に細胞が正常に (10 X 対物レンズと光/位相差顕微鏡を使用してフラスコから分離したことを確認してくださいにそれらをインキュベートし、フラスコから細胞を分離します。). は、trypsinization 反応を中和するために培養液の 4 mL を追加します。15 mL 遠心チューブに細胞懸濁液を転送します。 細胞のペレットを 4 分の 200 x 遠心 g。ゆっくりと、ペレットが外れないように世話、上清を吸引します。培地 5 mL にペレットを再停止します。 きれいな検定に細胞懸濁液の 20 μ L 因数を転送し、顕微鏡 10 X 対物レンズが装備を使用してセルをカウントします。 は、3 つの 35 mm 料理 90 mm ディッシュ内に配置することによって爆発のセルを準備します。適切にラベルを付けます。各 35 mm ディッシュの培地 2 mL に追加で一皿、皿全体に均一に細胞を配布する 5 x 10 の 4 セルの合計をシードします。衝撃波の前に適切なセルの添付ファイルを許可する標準的な培養条件で一晩実験サンプルをインキュベートします 。 注: 蛍光イメージングのセルする必要がある滅菌ガラス カバーガラス上。 2。管に衝撃を与える 図 2 : EVOC リグと衝撃管アセンブリ。(A) EVOC リグのイメージ。(B) 衝撃波管の概略図です。作動筒には内径が 59 mm と 4.13 m、EVOC リグを含む全体の長さが含まれます。駆動チューブの EVOC リグ合計 2.71 メートル長さ この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 組立手順中に仕事鋼鉄つま先のブーツおよび実験室のコートを着用します。 挿入 2 つのボルト穴を 2 つ配置バーは排気口フランジの水平面で発見します。排気口フランジと 前のヴィヴォ オルガン文化 (EVOC) リグとの間に収まるように配置バーの端にニトリル ゴム製ガスケット シートを配置します 。 注: EVOC リグは 35 mm ペトリ皿 ( 図 2 a) 用特注器具。 、配向正しく、そのベースにペトリ皿を握るセクションがある配置バーで器具をスライドして衝撃波管の出口フランジに EVOC リグを取り付けます。 は、残りの穴に 4 つの M24 ボルトとワッシャーを挿入します。彼らに触れるフランジ ナットを配置します。 しっかりと EVOC リグおよび衝撃管が正常に整列しているを視覚的にチェックしながらナットとボルトを対角的に対称的固定順にします。 圧力トランスデューサー EVOC リグにしセンサー ケーブルを使用して現在のソースにそれを接続します。その後、電流をオシロ スコープに接続する BNC ケーブルを使用しています。 ことを確認すべてのリリース バルブと衝撃波管のコントロールの流れが閉鎖されています。内蔵外部圧縮空気ラインを開き、手動で圧力調整弁を時計回り 2.5 バーにソレノイドを充電に回して 反時計回り 180 ° 回して圧縮ガス容器の安全弁を開きます。 ゆっくり回す圧力レギュレータ、時計回りに約 15 バーに圧力を高めるガス容器の上部にある 注: このレギュレータの設定ポイント必要があります少し上最高破裂する実験に使用される厚いダイヤフラムの圧力します。 は、10 cm × 10 cm の正方形に 0.125 mm の厚さのプラスチック シートを切断することによってダイヤフラムを準備します 。 注: ダイヤフラムの厚さ (すなわち、 厚いダイヤフラムに衝撃波大きいピーク圧力となります衝撃波のピーク圧力を変更する、破裂圧力に関連します。テーブル 1). マイラー ダイヤフラム寸法 (cm) バースト (棒) 圧力 センサー 3 圧レンジ (kPa) 10 x 10 x0.023 2 ± 0.2 47 ± 7.5 10 × 10 × 0.050 4 ± 0.2 72 ± 7.5 10 x 10 x 0.125 9.5 ± 0.5 127 ± 12.5 テーブル 1: ダイヤフラムの厚さとピーク圧に対応する圧力をバーストします。 テープからハンドルを作成、横隔膜の上下にそれらを修正および慎重に砲尾の部屋によってフロントの小さなフランジの横にあるダイアフラムの位置にそれらを使用します。骨盤を閉じる前に、横隔膜がストレートと位置が正しいことを確認します。 は 4 つの M24 ボルトとナットを使用してこれに安全します。斜め対称的に順番にナットとボルトをしっかりと固定します。 3。衝撃波にセルだけ事前の準備 紫外線殺菌を行い組織層流フードの準備。それを消毒ソリューションと 70% エタノールできれい。細胞事前に/ポスト-shock 処理に必要なすべての項目の露出を波し、無菌フード内に配置を収集します 。 注: これには、ピペット、ピペット、滅菌はさみ接着ガス透過性膜新鮮な媒体が含まれていますヒント。 無菌フードにインキュベーターから 3 つの実験サンプルを含む 1 つの 90 mm シャーレを転送します。 接着剤のガス透過性膜シート (材料の表 を参照してください)、六つの正方形にそれぞれが 1 つの 35 mm のペトリ皿の上をカバーするのに十分な大きさになるようカットします。 35 mm シャーレから培地を吸引、片側にふたを閉めて密封膜と皿の端の間は、接着剤のガス透過性膜の 2 つのセクションでカバーします。 EVOC リグにサンプルを転送し、皿の上が衝撃波管のインナー ベースと揃うように、治具のベースに固定します。 4。管操作に衝撃を与える ショック チューブ システムを加圧時に耳の守備、目のゴーグル、安全ブーツ、研究室コートを着用します。 衝撃波管に圧縮空気シリンダーを接続するフレキシブル ホースに流れるガスを許可する、時計回りにレギュレータを流量調節ノブをオンにします。 コントロール パネルの下部には、いずれかを選択、" ダブル骨盤 " 短期衝撃 wav の入口e または " ドライバー管 " 増加の波の持続期間のための入口です。 直流電源、オシロ スコープで波形データを集録するスイッチ。50.0 MS にオシロ スコープのサンプリング レートを設定/s、レコード長は 1 m のポイントします。50 の範囲を設定 2 バーで発射、100 mV 4 バー上の mV は、コントロール パネルの反対側の壁にスイッチを使って安全ライトをオンにします 。 注: この衝撃波管を充電時部屋に入るが他の研究者に指示します。 は、ソレノイドを閉じますソレノイド制御ボックスのスイッチをオンにします 。 注: この安全機能は、課金システムを可能にするダブル砲尾の部屋にあるバルブを閉じます。 コントロール パネルでゆっくりとノブを反時計回りに圧縮チャンバー内の圧力を徐々 に増やすことでフロー制御を開きます。コントロール パネルのディスプレイを使用して圧力を監視します。 一度横隔膜破裂圧力に達すると、横隔膜が破裂と " バン " 音が聞こえます。ノブを回すことによってフロー制御をすぐに閉じます 。 注: 衝撃波管が旅行されますセルのサンプルとチューブの端をします。 ソレノイド コントロール ボックスのスイッチをオフにするソレノイドを開き、(コントロール パネルの反対側の壁にスイッチを使用して) 安全光スイッチをオフ。 無菌フードにセルのサンプルを転送する、接着剤のガス透過性膜を削除、新鮮な成長培地 2 mL で皿を満たし。セルを手順 5 で説明したように評価のためすぐに使用または長期的な研究のためのインキュベーターに返されますできます。 5。細胞生 査定セル実行可能性次の酸化還元インジケーター試金とライブとデッド細胞の蛍光イメージングの組み合わせを使用して衝撃波 。 注: 蛍光イメージングのセルする必要がありますシード滅菌ガラス カバーガラス上セクション 1: 細胞文化およびサンプル準備。これらは 35 mm のペトリ皿内に配置することができます。 転送 200 μ L 酸化還元インジケーター試薬 (材料の表 を参照してください) 2 ml 中ショック後の補充直後に各実験的料理波露出。4 h の標準培養条件で孵化させなさい 各料理のいずれかブラック 2 × 100 μ 因数 (暗い無菌フード) に転送または蛍光や吸光度が生存率を評価するために使用されるかどうかによって、96 ウェル プレートをオフにします。 96 ウェルのプレートを正しいフィルター装備適切なプレート リーダーに転送し、蛍光または 570 励起バンド 530ex/590em を使用して読み取る nm 吸光度の 600 nm リファレンスと組み合わせます。エクスポートし、データを保存します。 細胞生存率の低下を示すことができますこの衝撃波にさらされたサンプルと非露出コントロール、違いを識別するためにデータを分析します 。 注: 陰性対照も実験的なデザインに含まする必要があります。セルの数値を計算するさらに、標準曲線の補間を使用できます。 は、酸化還元インジケーター試薬を含む培地を吸引します。新鮮な培地 2 mL に置き換えるし、24 時間の標準的な培養条件で細胞をインキュベート 2 番目の生存時間ポイントを取得する必要に応じて上記の手順を繰り返します。 ライブとデッド細胞の蛍光イメージング、培地を吸引し、2 回 1 mL の PBS のセルを洗浄します。転送 100 μ L イメージングは、完全な試薬の各サンプル キット (材料の表 を参照) と 15 分のためのライトから保護された室温でインキュベート 試薬を吸引させ 1 mL の PBS を使用。細かい点鉗子を使用して、慎重に、coverslip 35 mm ディッシュから取り外してガラス顕微鏡スライド上に下向きに配置します。 正しい刺激および放出フィルター装備 (10 X 対物レンズ開口数 0.50) 蛍光顕微鏡を用いた各サンプルの 取得画像 (ex/em 488 nm/515 nm と 570 nm/602 nm). 注: 生きているセルは強烈な制服、緑の蛍光を出します。死亡または危険にさらされた細胞膜細胞が取り込み死んでキット コンポーネント、セルの核の領域で主に見つけた赤い蛍光性の放出の結果します。 画像解析ソフトウェアのいずれかを手動でまたは自動的にそれぞれのイメージからライブとデッドの細胞の数をカウントを使用します。