Live-Imaging van antischimmelactiviteit door Human Primary neutrofielen en monocyten in reactie op<em> A. fumigatus</em

Het protocol voor het verkrijgen van neutrofielen en perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) zijn gebaseerd op de eerder gepubliceerde werkwijzen 9. Het gebruik van bloedmonsters van gezonde vrijwilligers is goedgekeurd door het menselijk onderzoek ethische commissie van de Universiteit van Aberdeen. Voordat u begint zorg ervoor dat alle ethische goedkeuringen zijn in de plaats voor het tekenen van bloed van gezonde vrijwilligers en / of patiënten met het oog op de beschreven experiment. Houd cellen op ijs waar mogelijk om hun overlevingskansen te vergroten. 1. A. fumigatus Cultuur en voorwaarden Bereid glucose minimale agar medium, zoals beschreven 10. Media passen tot pH 6,5 met behulp van 1 M NaOH en autoclaaf bij 120 ° C gedurende 20 minuten. Laat afkoelen tot 65 ° C. Werken in een steriele zuurkast Giet 30 ml gekoelde medium in een T75 kolf en laat afkoelen op de hals van de fles rust op een 25 ml pipet create een agar helling. Streak uit de DsRed Af293- A. fumigatus belasting van de agar en incubeer gedurende 7 dagen bij 37 ° C + 5% CO2. Twee kolven duurt ongeveer 10 9 conidia op in 5 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) vooraf biotinylatie. 2. A. fumigatus Labeling en voorbereiding Opmerking: Bij het uitvoeren van deze test voor het eerst bereiden de ouderlijke Af293- A. fumigatus stam. Monsters van beide stammen in microcentrifugebuizen en label slechts één van elke stam zoals hieronder beschreven. Dit zal toelaten dat een om de controle conidia te hebben met geen kleur en conidia met een enkele kleur, ofwel DsRed of AF633, om de installatie en apparatuur te testen. Oogst A. fumigatus conidia door onderdompeling van de kweek met 30 ml PBS + 0,05% Tween-80. Filtreer de verkregen suspensie door een 40 urn cel zeef in een 50 ml buis hyfenfragmenten verwijderen. Centrifuge bij 805 xg gedurende 10 minuten, verwijder het supernatant en was één keer in 20 ml steriel PBS. Pool conidia uit twee platen van dezelfde stam gedurende de wasstap. Na de wasstap, resuspendeer de pellet in 5 ml PBS en breng 1 ml porties van mondiale suspensie in microcentrifugebuizen. 1 ml suspensie van elke stam is meestal voldoende voor live cell imaging. Wikkel de overblijvende aliquots in folie en bewaar bij 4 ° C. Centrifuge monsters van mondiale suspensie bij 9300 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en verwijder supernatant. Resuspendeer de conidial pellet in 1 ml 0,05 M NaHCO3 pH 8,3. Bereid 10 mg biotine / 200 pl dimethylsulfoxide (DMSO) voorraadoplossing door reconstitutie 25 mg biotine in 500 ul DMSO. Voeg 10 ul biotine / DMSO stockoplossing aan de microcentrifugebuis, afdekking aluminiumfolie en incubeer gedurende 2 uur op een schudtafel bij 4 ° C. Aliquot de rest van de biotine / DMSO voorraad oplossing;n en invriezen bij -20 ° C voor gebruik in volgende experimenten. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 9300 x g en verwijder het supernatant. Resuspendeer de conidial pellet in 1 ml 100 mM Tris-HCl pH 8,0 gedurende 1 uur tot vrij zwevende biotine deactiveren. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 9300 x g en verwijder het supernatant. Was de pellet twee keer met 1 ml steriel PBS en resuspendeer de pellet in 1 ml PBS. Los 1 mg streptavidine-AF633 in 0,5 ml PBS om een ​​2 mg / ml voorraadoplossing te maken. Voeg 10 ul van 2 mg / ml streptavidine-AF633 per 1 ml mondiale suspensie en incubeer gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur op een schudtafel bedekt met aluminiumfolie. De resterende Streptavidine-AF633 kunnen worden ingevroren in porties voor toepassing in latere experimenten. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 9300 x g en verwijder supernatant. Resuspendeer de conidial pellet in 1 ml PBS en tel de conidia behulp van een hemocytometer bij een 1: 1000 verdunning (1: 100 en 1:10). Pas de conidial concentratie 3,6 x 10 6 / mL met CO2 onafhankelijke media, verpakken in folie en bewaar bij 4 ° C. LET OP: De conidia zijn nu gemerkt met AF633 en flare conidia zal worden aangeduid. Optioneel: als stimulatie met gezwollen conidia nodig, na het tellen conidia (stap 2,9), verdund conidia 7,2 x 10 6 / ml in gist stikstofbase (YNB) medium en voeg 500 ul mondiale suspensie en 4,5 ml YNB medium in een autoclaaf 50 mL Erlenmeyer kolf. Bedek en zet de kolf in een schudincubator (200 rpm bij 37 ° C) gedurende 6 uur. Breng het medium een ​​15 ml buis. Centrifugeer bij 805 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en eenmaal wassen in PBS. Centrifugeer opnieuw en resuspendeer pellet in 1 ml CO2 onafhankelijk medium, waardoor 3,6 x 10 6 conidia / ml. Opmerking: Conidia vaak klonteren nadat ze opzwellen maken nauwkeurige telling moeilijk is, is het raadzaam om te berekenen met de counted aantallen rust conidia gebruikt. 3. Isolatie van humane neutrofielen en monocyten Trek 20 ml veneus bloed van gezonde vrijwilligers in twee 10 ml buisjes met bloed ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA). Voor elke donor afzonderlijk giet 20 ml bloed in een buis van 50 ml en verdund met 15 ml PBS. Onderlaag het bloed met 15 ml van een lymfocyt isolatieoplossing (dichtheid 1,077 g / ml) met een spuit en naald ijzer. Plaats de naald op de bodem van de buis en voorzichtig dwingen lymfocyten isolatieoplossing out. Centrifugeer bij 630 xg gedurende 20 min zonder remmen en lage versnelling. Bereid PBS, gekoeld op ijs. OPMERKING: Stappen 3.4 en 3.5 worden gelijktijdig gevolgd om monocyten (3.4) en neutrofielen (3,5) te genereren. Gebruik een pastette, verzamel dan het PBMC-laag. Dit is de laag in het midden tussen de gele serum (boven) en de transparante lymfocyten isolatieoplossing (onderste) laag enover in een verse 50 ml buis. De buis met de PBMC tot 50 ml met koude PBS en centrifugeer bij 582 xg gedurende 10 min. Verwijder het supernatant en tweemaal wassen met koud PBS en resuspendeer in 1 ml PBS per 20 ml donorbloed aanvankelijk gebruikt. Maak 1:10 verdunningen voor het tellen door toevoeging van 20 pi van de celsuspensie 160 pi PBS en 20 pl van trypan blauw. Tellen cellen met een hemocytometer. Bereid een bufferoplossing door toevoeging van 26 ml door warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS) en 2,1 ml 0,5 M EDTA en 500 ml HBSS. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 515 xg en resuspendeer in 40 pl bufferoplossing per 1 x 10 7 cellen. Breng de celsuspensie aan een 15 ml buis en voeg 10 ul CD14 microparels per 1 x 10 7 cellen, meng en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C, en zorg ervoor dat de buizen te mengen om de 5 min. Was de cellen door toevoeging van 1 ml bufferoplossing per 1 x 10 7 cellen en centrifuge bij 515 xg gedurende 10 min. Aspireren supernatant en resuspendeer helemaal tot 1 x 10 8 cellen in 500 pi bufferoplossing. Plaats 1 kolom per monster op een magnetische afscheider volgens de instructies van de fabrikant. Was eerst de kolom eenmaal met 500 pi bufferoplossing. Pipet 500 pi celsuspensie door de kolom, wacht de kolom drogen en wassen herhalen driemaal met bufferoplossing. Plaats een nieuwe 15 ml buis onder de kolom en neem de kolom van de magnetische scheider. Spoel vervolgens de cellen uit de kolom in de buis met 1 ml bufferoplossing. Voeg 4 ml buffer oplossing en centrifugeer bij 515 xg gedurende 10 min, en vervolgens resuspenderen in 1 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium. Maak 1:10 verdunningen voor het tellen door toevoeging van 20 pi van de celsuspensie 160 pi PBS en 20 pl van trypan blauw. Tel de cellen met eenhemocytometer. Pas de celconcentratie 6 x 10 5 / ml met RPMI en zaden 200 ui op een 35 mm glas-based imaging dish. Incubeer overnacht bij 37 ° C met 5% CO2. De volgende dag vóór beeldvorming verwijderen RPMI en voeg 200 ul van CO2 onafhankelijk medium. Opmerking: Deze monocyten kan ook worden onderscheiden in verschillende macrofaag subsets voorafgaand aan de beeldvorming. Als dit is een techniek om ontdekt te worden, een uitstekend uitgangspunt is de recente paper van Ohradanova-Repic et al. 1 1. Na het oogsten van de PBMC laag, verwijder alle van het serum en de meeste lymfocyten isolatie oplossing, maar wees voorzichtig niet om de kleine witte band te verwijderen op de top van de rode pellet omdat dit het grootste deel van de neutrofielen zal bevatten. Bereid een 10x hypotone lysisbuffer voorraad door toevoeging van 83 g NH4Cl en 10 g KHCO3 in 1 liter steriel water. Bewaren bij 4 °C. Verdun deze voorraad 10x met steriel water en voeg deze toe aan de buizen. Vervolgens voorzichtig omkeren 3 keer en incubeer op ijs gedurende 15 minuten. Centrifugeer bij 394 xg gedurende 10 min en resuspendeer in hypotone lysisbuffer gedurende 10 minuten in ijs. Centrifugeer bij 394 xg en tweemaal wassen met koud PBS. Resuspendeer in 1 ml CO2 onafhankelijk medium per donor. Maak 1:10 verdunningen voor het tellen door toevoeging van 20 pi van de celsuspensie 160 pi PBS en 20 pl van trypan blauw. Tel de cellen met een hemocytometer. Voor flowcytometrie, dient de concentratie tot 6 x 10 5 / ml en voeg 400 ul celsuspensie aan een plaat met 24 putjes. Voor microscopie, voeg 200 ul van dezelfde celsuspensie 35 mm glas-based imaging dish. Opmerking: neutrofielen beeldvorming of flowcytometrie dient onmiddellijk gestart vanwege hun neiging om apoptose te ondergaan als ongestimuleerde verlaten. Als dit niet mogelijk is neutrofielen moeten worden gehouden opijs en die zo snel mogelijk (binnen één dag). 4. Flowcytometrie Voeg 200 ul van 1,2 x 10 6 / ml FLARE conidia aan de cellen in de plaat met 24 putjes, en daarna van 20 ug / ml voriconazol voeg 100 ul. Voeg 300 ul van RPMI en incubeer gedurende 16 uur bij 37 ° C met 5% CO2. OPMERKING: Voriconazol wordt toegevoegd aan conidial ontkieming te voorkomen. Voeg 25 ul van een 1 mM Calcofluor-witte voorraadoplossing in elk putje om een uiteindelijke concentratie van 25 uM en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C met 5% CO2. Centrifugeer bij 582 xg gedurende 10 min. Verwijder het supernatant en tweemaal wassen met PBS. Hechtende cellen (monocyten) geoogst, voeg 1 ml PBS met 3 mM EDTA aan elk putje en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C met 5% CO2. Voorzichtig te wassen cellen van de plaat door pipetteren en het verzamelen van cellen in een buis. Was eenmaal in FACS buffer (2% foetaal kalfsserum naar PBS), en vervolgens hersuspenderen in FACS buffer voor FACS-analyse. Voor FACS-analyse, eerst de compensatie parameters van de stroom aan te passen cytometer en stel positieve poorten met behulp van één kleur compensatie buizen, met inbegrip van conidia met geen kleur: DsRed + conidia, AF633 + conidia en Calcofluor White + conidia (gegenereerd zoals in 4.2). Bevrijd conidia poort gebaseerd op voorwaartse en zijwaartse verstrooiing gebruiken conidia geen kleur. Set cellen hek aan voorwaartse en zijwaartse verstrooiing door het uitsluiten van de vrije conidia poort. Analyseer monsterbuisje door het opnemen van 10.000 gebeurtenissen. OPMERKING: Cellen in verband met levende conidia zal worden DsRed + en AF633 +. Cellen in verband met dode conidia zal alleen AF633 +. Omstander cellen die niet zijn bezig conidia zal dsRed- en AF633-. De conidiën-actief celpopulaties worden verder geanalyseerd Calcofluor White-kleuring van de Pacific Blue kanaal. Conidia die buiten cellen blijven zal Calcofluor White + en conidia die zijn geïnternaliseerd zal zijnCalcofluor White-. 5. Live-Cell Video Microscopie Opmerking: De keuze van de microscoop afhankelijk zijn welke lokaal beschikbaar is, maar de microscoop opstelling moet een omgekeerde fase wordt een klimaatkamer bij 37 ° C en geschikte excitatie / emissie filters gedurende DsRed (532/561 nm) en AF633 omvatten (633 nm). FLARE conidia werken niet met de 488 nm laser in plaats van de 532/561 nm laser voor DsRed. Bij het uitvoeren van dit experiment voor de eerste keer, via het bedieningspaneel van conidia geen kleur en een kleur te testen voor achtergrondfluorescentie en doordrukken tussen de DsRed en AF633 kanalen. Schakel de microscoop verwarming voorafgaand aan het experiment en voldoende tijd voor het milieu stuurkamer opwarmen tot 37 ° C. De duur kamertemperatuur stabiliseren zal variëren voor verschillende opstellingen microscoop. Schakel de microscoop en computer, en loadvertentie van de imaging software. Monteer de beeldvorming schotel op de microscoop podium en stel de focus naar de menselijke neutrofielen of monocyten vinden. Voor DsRed en AF633, stelt het laservermogen tot 10% en belichtingstijd op 1 s in de overname-instellingen. Verwijder de beeldeenheid glijbaan en voeg 100 ul van 3 x 10 6 / ml FLARE mondiale suspensie aan de geschikte putjes (totaal volume 300 ul / well). Noteer de tijd die flare conidia worden toegevoegd aan het gerecht. Zet de schuif naar het podium en aan te passen camera gevoeligheid voor DsRed en AF633 om duidelijk te zien de conidia maar niet overbelichten het beeld. Het opzetten van een podium punten lijst als multi-point acquisitie is vereist. Begonnen afbeelden wanneer alle punten in focus zijn de kanalen geoptimaliseerd en de cyclustijd en duur is ingesteld. Cyclustijd en duur van beeldvorming afhankelijk van de experimentele vraag. Het doel is om de cyclustijd zo kort mogelijk (≤2 min) 1 min houden waardoor diepgaande analyse van upgake dynamiek.