为了应对抑菌活性的实时成像人力初级中性粒细胞和单核细胞<em>一种。曲霉</em

用于获得中性粒细胞和外周血单核细胞（PBMC）的协议是基于以前出版的方法9。使用来自健康志愿者的血液样本已通过阿伯丁大学的人类研究伦理委员会。开始之前，确保所有的伦理审批到位从健康志愿者和/或病人抽血所描述实验的目的。在冰上保持在可能情况下，以增加他们的生存细胞。 1. 烟曲霉文化条件如所描述的10制备葡萄糖基本琼脂培养基上。 调整媒体使用1M NaOH将pH为6.5并高压釜在120℃下20分钟。 使其冷却至65℃。 在无菌流罩的工作，倒入30毫升冷却介质成T75烧瓶中并允许与静止烧瓶的颈部冷却上的25毫升吸移管至create琼脂斜面。 条纹列于琼脂DSRED Af293- 烟曲霉菌株，在37℃+/- 5％CO 2孵育7天。两个烧瓶将在5mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）预生物素化，得到大约10 9个分生孢子。 2. 烟曲霉标签和制备注意：当首次执行该测定中，制备亲本Af293- 烟曲霉菌株。采取两种菌株的样品中的微量离心管中并且如下所述仅标记每个菌株中的一个。这将允许一个有控制的分生孢子没有颜色和分生孢子用单一颜色，无论是红色荧光蛋白或AF633，测试设置和设备。 通过用30mL PBS + 0.05％吐温-80中浸渍培养收获烟曲霉分生孢子。通过40微米的细胞过滤到50mL管过滤所得悬浮液，以除去菌丝片段。 Centrifuge在805×g离心10分钟，除去上清液，并在20毫升无菌PBS洗一次。在洗涤步骤中从相同菌株的两个板池分生孢子。 在洗涤步骤之后，重新悬浮于5mL PBS的颗粒和转印分生孢子悬浮液的1ml等份到微量离心管中。 1mL的悬浮液各菌株的通常足以用于活细胞成像。包裹在箔和存储剩余的等分试样在4℃下。 在9300×g下在室温下10分钟，并小心地分生孢子悬浮液的等分试样离心除去上清液。重悬沉淀分生孢子在1mL的0.05M的NaHCO 3 pH值8.3。 通过在500μL的DMSO重构25毫克生物素制备10毫克生物素/ 200μL二甲亚砜（DMSO）储备液。添加10μL生物素/ DMSO原液到微量离心管中，在盖铝箔，并培育2小时上在4℃下的摇杆。 分装的生物素/ DMSO股票搜索解决方案的剩余部分n和在-20℃下，在随后的实验中使用的冻结。 离心10分钟，在9300×g下，小心地除去上清。重悬在1mL的100mM的Tris-HCl的pH 8.0的分生孢子沉淀1个小时以失活自由浮动生物素。 离心10分钟，在9300×g下，小心地除去上清。用1mL无菌PBS洗涤沉淀两次，重悬沉淀在1mL的PBS中。 溶解1毫克链霉亲和AF633的0.5毫升的PBS使一个2mg / mL的储备溶液。加入2 mg / mL的链霉亲和AF633的10μL每1mL分生孢子悬浮液的孵育在室温下在铝箔覆盖摇臂40分钟。其余的链霉亲和AF633可以等分被冻结在随后的实验中使用。 离心10分钟，在9300×g下，小心地取出上清。重悬沉淀分生孢子在1mL的PBS中，并在1计数使用血球分生孢子：1,000稀释液（1：100，然后1:10）。调整分生孢子浓度3.6×10 6个 / mL的用CO 2独立媒体，在4℃下在箔和存储包裹。 注：现在的分生孢子都标有AF633，并将作为FLARE分生孢子被称为。 可选：如果需要与肿分生孢子刺激，计数分生孢子（步骤2.9）后，稀释分生孢子至7.2×10 6个 / mL，在酵母氮基（YNB）培养基中，并在高压灭菌50加入500μL分生孢子悬浮液至4.5毫升YNB培养基姆·埃伦迈尔瓶中。覆盖并放置在烧瓶6小时振荡培养箱（37℃200rpm下）。 所述介质转移到15毫升管。离心机中以805×g于室温下10分钟，并在PBS中洗涤一次。再次离心，重悬沉淀在1毫升CO 2独立介质，给予3.6×10 6个分生孢子/ ml。 注：分生孢子经常聚集他们变得肿胀进行准确的计算困难后，建议用C来计算ounted数字静止使用分生孢子。 3.人体中性粒细胞和单核细胞的分离绘制20毫升的来自健康志愿者的静脉血液到含有乙二胺四乙酸（EDTA）2个10毫升血管中。用于分开每个供体，倒入20毫升血液中的50mL管中，用15mL PBS稀释。 下垫的血液用15ml淋巴细胞分离溶液（密度1.077克/毫升）用注射器和针铁的。放置针在管的底部，轻轻迫使淋巴细胞分离溶液进行。离心机中以630×g离心20分钟，不制动和低加速。 准备PBS，在冰上冷却。 注意：步骤3.4和3.5必须同时遵循以产生的单核细胞（3.4）和嗜中性粒细胞（3.5）。 使用pastette，收获PBMC层。这是在黄色血清（上）和透明淋巴细胞分离溶液（低级）层之间的中心的层，和转移到新的50ml管中。 装满PBMC管高达50毫升用冷PBS和离心机中以582×g离心10分钟。去除上清，每20毫升的供体血液最初使用在1mL的PBS中用冷PBS重悬洗两次。 使1:10稀释液通过将细胞悬浮液于160μLPBS中和台盼蓝的20μL的20μL计数。计数和血球细胞。 通过加入26毫升热灭活的胎牛血清（FCS）和2.1毫升的0.5M的EDTA至500mL HBSS的制备缓冲溶液。离心将细胞在515×g离心10分钟，并再悬浮于每1×10 7细胞缓冲溶液40μL。 细胞悬液转移到15毫升管中并每1×10 7细胞添加CD14微珠的10μL，拌匀，并在4℃下孵育15分钟，确保所述管混合，每5分钟。 通过加入每1×10 7个细胞和CEN缓冲溶液1ml洗涤细胞trifuge在515×g离心10分钟。 吸去上清液完全，重悬到1×10个8个细胞中的缓冲溶液500微升。 根据制造商的说明放置每个样品1列上的磁分离器。首先用缓冲液500μL洗涤柱一次。 通过该柱吸取细胞悬浮液的500μL，等待柱干燥，然后通过用缓冲溶液重复该三次洗涤。 将新的15毫升管中的列的下面，并采取柱切断电磁分离器。然后冲洗细胞出列入用1mL的缓冲溶液的试管中。 加入4毫升缓冲溶液和离心机在515×g离心10分钟，然后在1mL的Roswell Park Memorial研究所（RPMI）培养基重悬。 使1:10稀释液通过将细胞悬浮液于160μLPBS中和台盼蓝的20μL的20μL计数。计数和细胞血球。 调节细胞浓度为6×10 5 / mL的用RPMI和在基于玻璃35毫米成像菜种子200μL。在37℃用5％CO 2孵育过夜。 第二天，在成像之前，取出RPMI并添加CO 2独立介质的200μL。 注意：这些单核细胞也可以分化成成像之前各种巨噬细胞子集。如果这是要探索的技术，一个很好的起点是由Ohradanova-Repic 等人最近的纸张。 1。 收获PBMC层后，除去所有的血清和大部分淋巴细胞分离溶液，但要小心，不要除去上冲粒料，因为这将包含大多数的嗜中性粒细胞的顶部上的小的白色带。 通过添加83克NH 4的Cl和在1升无菌水10克KHCO 3的制备10个的低渗裂解缓冲液贮液。保存在4°C。 这个稀释10倍的股票用无菌水，并把它添加到管。然后，小心地反转3次，并在冰上孵育15分钟。 离心机中以394×g离心10分钟，并再悬浮在低渗裂解缓冲液在冰中10分钟。 离心机394 XG，用冷PBS洗两次。重悬在1mL每个供体的CO 2独立培养基。 使1:10稀释液通过将细胞悬浮液于160μLPBS中和台盼蓝的20μL的20μL计数。计数与血球细胞。 用于流式细胞术，调至浓度为6×10 5 / mL和400μL细胞悬浮液添加到24孔板中。对于显微镜，添加相同的细胞悬浮液的200μL到基于玻璃35毫米成像盘中。 注：中性粒细胞成像或流式细胞术应立即开始，由于他们的倾向，如果没有刺激发生凋亡。如果这是不可能的嗜中性粒细胞应保持在冰并尽快用作可能的（在同一天之内）。 4.流式细胞仪添加1.2×10 6 / mL的FLARE分生孢子200μL到在24孔板中的细胞中，然后添加20μg/ ml的伏立康唑的100μL。添加RPMI的300μL，并且在37℃用5％CO 2孵育16小时。 加入伏立康唑，防止孢子萌发：注意。 添加25μL1 mM的卡尔科弗卢尔白色原液向每个孔为25μm的终浓度，并在37℃用5％CO 2孵育10分钟。 离心机中以582×g离心10分钟。除去上清液，并用PBS洗两次。 收获贴壁细胞（单核细胞）中，用3mM的EDTA添加1毫升的PBS至每个孔，并在37℃用5％CO 2孵育10分钟。轻轻用移液管洗涤细胞从板上收集的细胞在管中。 在FACS缓冲液洗一次（2％胎牛血清到PBS），然后在FACS缓冲液悬浮于FACS分析。 对于FACS分析，首先流式细胞仪调节流量的补偿参数，并设置使用单彩色补偿管正面门，包括分生孢子没有颜色：红色荧光蛋白+分生孢子，AF633 +分生孢子，并卡尔科弗卢尔白+分生孢子（如在4.2生成）。 设置免费分生孢子门上了基于使用没有颜色的分生孢子侧向散射。通过排除免费分生孢子门上的前向和侧向散射设置单元门。 通过记录10,000个事件分析样品管中。 注：用活分生孢子相关细胞将红色荧光蛋白+和AF633 +。与死亡有关的分生孢子细胞只会AF633 +。那些没有从事分生孢子会dsRed-和AF633-旁观者细胞。分生孢子，从事细胞群进一步分析了太平洋上的蓝色通道卡尔科弗卢尔白染色。已经内化分生孢子仍然存在细胞外将卡尔科弗卢尔白+，和分生孢子会卡尔科弗卢尔白色 – 。 5.活细胞显微视频注意：显微镜的选择将取决于什么是本地可用的，但在显微镜的设置将需要包括倒置的阶段，加热至37℃和适当的激发/发射过滤器的DsRed（五百六十一分之五百三十二nm）与AF633环境室（633纳米）。 FLARE分生孢子不与488 nm激光代替五百六十一分之五百三十二nm激光对红色荧光蛋白的工作。当与此第一次执行该实验中，使用控制分生孢子没有颜色和单色测试对于背景荧光和红色荧光蛋白和AF633信道之间的渗出通过。 打开之前的实验显微镜加热器，并允许足够的时间使环境控制腔室温至37℃。以稳定采取的腔室温度的时间将不同的显微镜设置而变化。 打开显微镜和计算机，LO广告中的成像软件。安装在显微镜载物台的摄像培养皿中并调节焦距以找到人类嗜中性粒细胞或单核细胞。 对于红色荧光蛋白和AF633，在采集设置设定的激光功率到10％和曝光时间为1秒。 取出成像滑动，并添加100微升的3×10 6个 / mL的FLARE分生孢子悬浮液到适当的孔中（总体积300μL/孔）。录制FLARE分生孢子添加到菜的时间。 返回滑动到舞台和调整的DsRed和AF633摄像机的灵敏度清楚地看到分生孢子但不是过度曝光图像。如果需要多点采集设置一个阶段点列表。 开始成像时的所有点都在焦点中，通道被优化和循环时间和持续时间被设置。周期时间和成像持续时间取决于试验问题。的目标是保持周期时间尽可能地短（≤2分钟）1分钟在UPT的深入分析允许AKE动态。