Immagini dal vivo di antifungini attività da Human neutrofili e monociti primaria in risposta a<em> A. fumigatus</em

Il protocollo per ottenere neutrofili e cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) è basato su metodi precedentemente pubblicati 9. L'uso di campioni di sangue di volontari sani è stato approvato dal comitato etico della ricerca umana dell 'Università di Aberdeen. Prima di iniziare assicurarsi che tutte le approvazioni etiche sono a posto per un prelievo di sangue di volontari sani e / o pazienti per lo scopo dell'esperimento descritto. Mantenere le cellule in ghiaccio, ove possibile, di aumentare la loro sopravvivenza. 1. A. fumigatus, Cultura e Condizioni Preparare glucosio agar minimo come descritto 10. Regolare mezzi a pH 6,5 usando NaOH 1 M e autoclave a 120 ° C per 20 min. Lasciare raffreddare a 65 ° C. Lavorando in una cappa a flusso sterile, versare 30 mL di supporti raffreddati in un pallone T75 e lasciar raffreddare il collo del pallone di riposo su una pipetta 25 ml di cReate una pendenza agar. Striscia la DsRed Af293- ceppo A. fumigatus sull'agar e incubare per 7 giorni a 37 ° C + 5% di CO 2. Due boccette produrrà circa 10 9 conidi in 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) pre-biotinilazione. 2. A. fumigatus etichettatura e preparazione Nota: Quando si esegue questo test per la prima volta, preparare il parental Af293- ceppo A. fumigatus. Prelevare campioni di entrambi i ceppi in provette per microcentrifuga ed etichettare solo uno di ogni ceppo come descritto di seguito. Ciò permetterebbe di avere il controllo conidi senza colore e conidi con un solo colore, sia DsRed o AF633, per testare la configurazione e le attrezzature. Raccolto A. fumigatus conidi immergendo la coltura con 30 ml di PBS + 0,05% Tween-80. Filtrare la sospensione risultante attraverso un colino cella 40 micron in una provetta da 50 ml per rimuovere i frammenti ifali. Centrifuge a 805 xg per 10 min, rimuovere il surnatante e lavare una volta in 20 mL di PBS sterile. Piscina conidi da due piastre dello stesso ceppo durante la fase di lavaggio. Dopo la fase di lavaggio, risospendere il pellet in 5 ml di PBS e trasferimento 1 ml della sospensione di conidi in provette per microcentrifuga. 1 ml di sospensione di ciascun ceppo è solitamente sufficiente per cellule vive. Avvolgere le aliquote restanti in fogli e conservare a 4 ° C. aliquote centrifuga di sospensione di conidi a 9.300 xg per 10 minuti a temperatura ambiente e rimuovere con attenzione il surnatante. Risospendere il pellet di conidi in 1 mL 0,05 M NaHCO 3 pH 8,3. Preparare 10 mg di biotina / 200 pl dimetilsolfossido soluzione madre (DMSO) ricostituendo 25 mg di biotina in 500 microlitri di DMSO. Aggiungere 10 microlitri biotina / soluzione stock DMSO alla provetta, coperchio in foglio di alluminio e incubare per 2 ore su un agitatore meccanico a 4 ° C. Aliquotare il resto della biotina / DMSO archivio solution e congelare a -20 ° C per l'uso in esperimenti successivi. Centrifugare per 10 minuti a 9300 xg e rimuovere con attenzione il surnatante. Risospendere il pellet di conidi in 1 ml di 100 mM Tris-HCl pH 8,0 per 1 ora per disattivare biotina liberamente fluttuante. Centrifugare per 10 minuti a 9300 xg e rimuovere con attenzione il surnatante. Lavare il pellet due volte con 1 ml di PBS sterile e risospendere il pellet in 1 ml di PBS. Sciogliere 1 mg di streptavidina-AF633 in 0,5 mL di PBS per fare un / soluzione madre 2 mg mL. Aggiungere 10 ml di 2 mg / mL streptavidina-AF633 per 1 ml di sospensione di conidi e incubare per 40 minuti a temperatura ambiente su un agitatore meccanico coperto in foglio di alluminio. Il restante Streptavidina-AF633 può essere congelato in aliquote per l'uso in esperimenti successivi. Centrifugare per 10 minuti a 9300 xg e rimuovere con attenzione il surnatante. Risospendere il pellet di conidi in 1 ml di PBS e contare il conidi con un emocitometro a una diluizione 1: 1.000 (1: 100 e poi 1,10). Regolare la concentrazione conidi di 3,6 x 10 6 / ml con CO 2 media indipendenti, avvolgerlo in carta e conservare a 4 ° C. NOTA: I conidi sono ora etichettati con AF633 e verranno indicati come FLARE conidi. Opzionale: Se è necessaria la stimolazione con conidi gonfio, dopo aver contato conidi (passo 2.9), diluire conidi di 7,2 x 10 6 / ml in base azotata di lievito (YNB) medio e aggiungere 500 microlitri sospensione di conidi di 4,5 ml YNB medie un autoclavato 50 mL beuta. Coprire e posizionare il pallone in un incubatore scuotimento (200 rpm a 37 ° C) per 6 ore. Trasferire il medio in una provetta da 15 ml. Centrifugare a 805 xg per 10 min a temperatura ambiente e lavare una volta in PBS. Centrifuga di nuovo e risospendere pellet in 1 ml di CO 2 media indipendenti, dando 3.6 x 10 6 conidi / mL. Nota: Conidi spesso ciuffo dopo che diventano gonfie rendendo difficile un conteggio preciso, si consiglia di calcolare con la cNumeri ounted di conidi utilizzati riposo. 3. Isolamento di neutrofili umani e monociti Disegnare 20 ml di sangue venoso da volontari sani in due provette di sangue 10 mL contenenti acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Per ciascun donatore separatamente, versare 20 ml di sangue in una provetta da 50 ml e diluire con 15 ml di PBS. Alla base del sangue con 15 mL di una soluzione di isolamento dei linfociti (densità 1.077 g / mL) con un ago della siringa e ferro. Posizionare l'ago nella parte inferiore del tubo e forzare delicatamente la soluzione di isolamento dei linfociti fuori. Centrifugare a 630 xg per 20 minuti senza freno e bassa accelerazione. Preparare PBS, raffreddato in ghiaccio. NOTA: i passaggi 3.4 e 3.5 deve essere seguita contemporaneamente per generare monociti (3.4) e neutrofili (3.5). Utilizzando un pastette, raccogliere lo strato PBMC. Questo è lo strato al centro tra il siero giallo (superiore) e la soluzione trasparente isolamento dei linfociti (inferiore) strato, etrasferire in un tubo da 50 ml fresca. Riempire il tubo con PBMC fino a 50 ml con PBS freddo e centrifugare a 582 xg per 10 min. Rimuovere il surnatante e lavare due volte con PBS freddo e risospendere in 1 ml di PBS per 20 ml di sangue del donatore utilizzati inizialmente. Fare diluizioni 1:10 per il conteggio aggiungendo 20 microlitri della sospensione cellulare a 160 ml di PBS e 20 ml di trypan blu. Contare le cellule con un emocitometro. Preparare una soluzione tampone con l'aggiunta di 26 mL di calore inattivato siero fetale di vitello (FCS) e 2,1 ml di 0,5 M EDTA a 500 ml di HBSS. Centrifugare le cellule per 10 min a 515 xg e risospendere in 40 ml di soluzione tampone a 1 x 10 7 cellule. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e aggiungere 10 ml di microperle CD14 per 1 x 10 7 cellule, mescolare bene e incubare per 15 min a 4 ° C, avendo cura di mescolare i tubi ogni 5 min. Lavare le cellule aggiungendo 1 ml di soluzione tampone a 1 x 10 7 cellule e centrifuge a 515 g per 10 min. Aspirare il surnatante e risospendere completamente fino a 1 x 10 8 cellule in 500 microlitri di soluzione tampone. Mettere 1 colonna per campione su un separatore magnetico secondo le istruzioni del produttore. Prima lavare la colonna una volta con 500 ml di soluzione tampone. Pipetta 500 microlitri di sospensione cellulare attraverso la colonna, attendere che la colonna asciugare e poi lavare ripetendo questo tre volte con soluzione tampone. Posizionare un nuovo tubo 15 ml sotto la colonna e la colonna prendere fuori dal separatore magnetico. Poi lavare le cellule fuori della colonna nel tubo di 1 mL di soluzione tampone. Aggiungere 4 ml di soluzione tampone e centrifugare a 515 xg per 10 minuti, e poi risospendere in 1 ml di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) di media. Fare diluizioni 1:10 per il conteggio aggiungendo 20 microlitri della sospensione cellulare a 160 ml di PBS e 20 ml di trypan blu. Contare le cellule con unemocitometro. Regolare la concentrazione cellulare a 6 x 10 5 / mL con RPMI e sementi 200 microlitri su un piatto di imaging basata vetro da 35 mm. Incubare per una notte a 37 ° C con 5% di CO 2. Il giorno dopo, prima di imaging, rimuovere il RPMI e aggiungere 200 ml di CO 2 di media indipendenti. Nota: Questi monociti possono essere differenziate in diversi sottoinsiemi dei macrofagi prima di imaging. Se questa è una tecnica da esplorare, un eccellente punto di partenza è il recente lavoro di Ohradanova-Repic et al. 1 1. Dopo la raccolta strato PBMC, rimuovere tutto il siero e la maggior parte della soluzione di isolamento dei linfociti, ma attenzione a non rimuovere il nastrino bianco sulla parte superiore del sedimento rosso come questo contiene la maggior parte dei neutrofili. Preparare un tampone 10x ipotonico lisi magazzino aggiungendo 83 g di NH 4 Cl e 10 g di KHCO 3 in 1 L di acqua sterile. Conservare a 4 °C. Diluire tale stock 10x con acqua sterile e aggiungerlo ai tubi. Quindi, capovolgere con cautela 3 volte e incubare in ghiaccio per 15 min. Centrifugare a 394 xg per 10 minuti e risospendere in tampone di lisi ipotonica per 10 min in ghiaccio. Centrifugare a 394 xg e lavare due volte con PBS freddo. Risospendere in 1 mL di CO 2 media indipendenti per donatore. Fare diluizioni 1:10 per il conteggio aggiungendo 20 microlitri della sospensione cellulare a 160 ml di PBS e 20 ml di trypan blu. Contare le cellule con un emocitometro. Citometria a flusso, regolare la concentrazione di 6 x 10 5 / mL e aggiungere sospensione cellulare 400 microlitri di una piastra da 24 pozzetti. Per la microscopia, aggiungere 200 microlitri della stessa sospensione cellulare ad un piatto di imaging basata vetro da 35 mm. Nota: l'imaging dei neutrofili o citometria a flusso deve essere iniziato immediatamente a causa della loro propensione a subire apoptosi se lasciato non stimolato. Se questo non è possibile neutrofili devono essere tenuti inghiaccio e utilizzato il più presto possibile (entro lo stesso giorno). 4. Citometria a Flusso Aggiungere 200 ml di 1,2 x 10 6 / ml FLARE conidi alle cellule nella piastra a 24 pozzetti, e quindi aggiungere 100 ml di 20 mg / mL voriconazolo. Aggiungere 300 ml di RPMI e incubare per 16 ore a 37 ° C con 5% di CO 2. NOTA: Voriconazolo viene aggiunto per impedire la germinazione dei conidi. Aggiungere 25 ml di una soluzione stock 1 mM calcofluor-bianco a ciascun pozzetto per una concentrazione finale di 25 pM e incubare per 10 min a 37 ° C con 5% di CO 2. Centrifugare a 582 g per 10 min. Rimuovere il surnatante e lavare due volte con PBS. Per raccogliere cellule aderenti (monociti), aggiungere 1 ml di PBS con 3 mM EDTA a ciascun pozzetto e incubare per 10 min a 37 ° C con 5% di CO 2. lavare delicatamente le cellule dalla piastra pipettando e raccogliere le cellule in un tubo. Risciacquare una volta in tampone FACS (2% siero di vitello fetale al PBS), e poi risospendere in FACS buffer per analisi FACS. Per l'analisi FACS, prima regolare i parametri di compensazione del citometro a flusso e impostare cancelli positivi utilizzando tubi di compensazione monocromatiche, incluse conidi senza colore: DsRed + conidi, AF633 + conidi e Calcofluor bianco + conidi (generato come in 4.2). Impostare cancello libera conidi basa su avanti e scatter laterale utilizzando conidi con nessun colore. Situato porta cellulare su avanti e scatter lato escludendo la porta conidi libero. Analizzare provetta registrando 10.000 eventi. NOTA: Le cellule associati conidi dal vivo saranno DsRed + e + AF633. Le cellule associate a conidi morti saranno solo AF633 +. cellule bystander che non sono impegnati conidi sarà dsRed- e AF633-. Le popolazioni di cellule conidi-impegnati sono ulteriormente analizzati per la colorazione bianca calcofluor sul canale Pacific Blue. Conidi che restano al di fuori delle cellule sarà calcofluor Bianco +, e conidi che sono stati internalizzati sarannoCalcofluor Bianco-. 5. Live Cell microscopio video Nota: La scelta del microscopio dipenderà ciò che è disponibile localmente, ma la configurazione microscopio dovrà prevedere una fase invertita, una camera ambientale riscaldata a 37 ° C e filtri di eccitazione / emissione appropriati per DsRed (532/561 nm) e AF633 (633 nm). conidi FLARE non funzionano con il laser 488 nm al posto del laser 532/561 nm per DsRed. Quando si esegue questo esperimento per questa prima volta, utilizzare il conidi di controllo con nessun colore e il colore unico per verificare fluorescenza di fondo e sanguinare-through tra la DsRed e canali AF633. Accendere il riscaldamento microscopio prima dell'esperimento e consentire un tempo sufficiente per la camera di controllo ambientale riscaldare a 37 ° C. Il tempo necessario per la temperatura della camera di stabilizzazione varierà per differenti configurazioni microscopio. Accendere il microscopio e il computer, ed eccoannuncio il software di imaging. Montare il piatto di imaging sul palco microscopio e regolare la messa a fuoco per trovare i neutrofili o monociti umani. Per DsRed e AF633, impostare la potenza del laser al 10% e il tempo di esposizione di 1 s nelle impostazioni di acquisizione. Rimuovere il vetrino imaging e aggiungere 100 ml di 3 x 10 6 / ml FLARE sospensione di conidi nei rispettivi pozzetti (volume totale 300 pl / pozzetto). Registrare il tempo che FLARE conidi vengono aggiunti al piatto. Riportare la diapositiva per il palco e regolare la sensibilità della fotocamera per DsRed e AF633 di vedere chiaramente la conidi ma non overexpose l'immagine. Impostare un elenco dei punti di fase se è richiesta l'acquisizione multi-point. Iniziano l'imaging quando tutti i punti sono a fuoco, i canali sono ottimizzate e il tempo di ciclo e la durata è impostato. Tempo di ciclo e la durata delle immagini dipendono dalla domanda sperimentale. L'obiettivo è di mantenere il tempo di ciclo più breve possibile (≤2 min) con 1 min consentendo analisi approfondite uptdinamica ake.