Живая съемка противогрибковой активности на человеке первичных нейтрофилов и моноцитах в ответ на<em> A. fumigatus</em

Протокол для получения нейтрофилов и мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) основан на ранее опубликованных методов 9. Использование образцов крови здоровых добровольцев было одобрено человеком исследований комитета по этике Университета Абердина. Перед началом убедитесь, что все этические утверждения в месте забора крови у здоровых добровольцев и / или пациентов с целью описываемого эксперимента. Держите клетки на льду, где это возможно, чтобы увеличить их выживание. 1. A. fumigatus Культура и условия Подготовка к глюкозе минимальной агаризованной среды , как описано 10. Настройка средств массовой информации до рН 6,5 с помощью 1 М NaOH и автоклаве при 120 ° С в течение 20 мин. Дать остыть до 65 ° С. Работа в стерильном капоте потока, заливают 30 мл охлажденных сред в T75 колбу и дать остыть с горловиной колбы покоящегося на 25 мл пипетку сreate агар склон. Серия из штамма A. fumigatus DsRed Af293- на агар и инкубируют в течение 7 дней при 37 ° С + 5% CO 2. Две колбы дадут приблизительно 10 9 конидий в 5 мл фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) , предварительно биотинилирования. 2. А. fumigatus Маркировка и подготовка Примечание: При выполнении этого теста в первый раз, подготовить родителей Af293- А. fumigatus штамма. Взять образцы обоих штаммов в микроцентрифужных пробирках и маркировать только один из каждого штамма, как описано ниже. Это позволит иметь один контрольные конидии, без цвета и конидий с одним цветом, либо Dsred или AF633, чтобы проверить установку и оборудование. Урожай конидии А. fumigatus путем погружения культуры с 30 мл PBS + 0,05% Твин-80. Фильтр полученной суспензии через сито 40 мкм клетки в трубку 50 мл, чтобы удалить фрагменты гиф. Сentrifuge при 805 х г в течение 10 мин, удалить супернатант и мыть один раз в 20 мл стерильной PBS. Бассейн конидии из двух пластин одного и того же штамма во время этапа стирки. После стадии промывки, ресуспендирует осадок в 5 мл PBS и перенос 1 мл аликвоты суспензии конидий в микроцентрифужные пробирки. 1 мл суспензии каждого штамма, как правило, достаточно для получения изображений живых клеток. Заверните оставшиеся аликвоты в фольгу и хранят при температуре 4 ° С. Центрифуга аликвоты суспензии конидий на 9300 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре и тщательно удалить надосадочную жидкость. Ресуспендируют осадок в конидий 1 мл 0,05 М NaHCO 3 рН 8,3. Подготовьте 10 мг биотина / 200 мкл диметилсульфоксиде (ДМСО) маточного раствора путем восстановления 25 мг биотина в 500 мкл ДМСО. Добавьте 10 мкл ДМСО / биотин маточного раствора в микроцентрифужных трубки, крышку в алюминиевую фольгу и инкубируют в течение 2 часов на качалке при 4 ° С. Алиготе остаток биотина / ДМСО SOLUTIOп и замерзает при -20 ° C для использования в последующих экспериментах. Центрифуга течение 10 мин при 9300 х г и осторожно удалить супернатант. Ресуспендирует осадок в конидиях 1 мл 100 мМ Трис-HCl, рН 8,0 в течение 1 ч, чтобы деактивировать свободно плавающий биотин. Центрифуга течение 10 мин при 9300 х г и осторожно удалить супернатант. Промывают осадок дважды 1 мл стерильной PBS и ресуспендируют осадок в 1 мл PBS. Растворите 1 мг стрептавидина-AF633 в 0,5 мл PBS, чтобы сделать 2 мг / мл маточного раствора. Добавить 10 мкл 2 мг / мл стрептавидин-AF633 на 1 мл суспензии конидий и инкубируют в течение 40 мин при комнатной температуре на качалке, покрытой алюминиевой фольгой. Остальные стрептавидины-AF633 может быть заморожен в аликвотах для использования в последующих экспериментах. Центрифуга течение 10 мин при 9300 х г и осторожно удалить надосадочную жидкость. Ресуспендируют осадок конидий в 1 мл PBS и считать конидии с использованием гемоцитометра при 1: 1000 разбавлении (1: 100, а затем 1:10), Регулировка конидий концентрации до 3,6 × 10 6 / мл с помощью СО 2 независимых средств массовой информации, завернуть в фольгу и хранить при температуре 4 ° С. Примечание: Конидии теперь помечены AF633 и будет называться FLARE конидий. Необязательно: Если стимуляция опухшие конидий требуется, после подсчета конидии (этап 2.9), разбавленных конидии до 7,2 × 10 6 / мл в базе дрожжевого азота (YNB) среду и добавляют 500 мкл конидий суспензии до 4,5 мл YNB среды в автоклавируют 50 мл колбу Эрленмейера. Накройте и колбу помещают в инкубатор встряхивания (200 оборотов в минуту при 37 ° C) в течение 6 ч. Передача среды в трубке 15 мл. Центрифуга при 805 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре и мыть один раз в PBS. Центрифуга снова и ресуспендируют осадок в 1 мл CO 2 независимых среды, что дает 3,6 × 10 6 конидий / мл. Примечание: Конидии часто комок после того, как они становятся раздутыми сделать точный подсчет трудно, рекомендуется вычислять с сounted количество отдыха конидии используемой. 3. Выделение человека нейтрофилы и моноциты Draw 20 мл венозной крови от здоровых добровольцев на две пробирки 10 мл крови, содержащих этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА). Для каждого донора в отдельности, заливают 20 мл крови в пробирку 50 мл и разбавляют 15 мл PBS. Underlay крови с 15 мл раствора изоляции лимфоцитов (плотность 1,077 г / мл) с помощью шприца и игл железа. Поместите иглу в нижней части трубы и осторожно заставить раствор изоляции из лимфоцитов. Центрифуга при 630 х г в течение 20 мин, без тормозов и низким ускорением. Приготовьте PBS, охлажденное на льду. Примечание: Шаги 3.4 и 3.5 должны соблюдаться одновременно генерировать моноциты (3.4) и нейтрофилов (3.5). Использование pastette, собрать слой РВМС. Это слой в центре между желтой сывороткой (верхней) и раствором прозрачной изоляции лимфоцитов (нижним) слоем, иперенести в свежую пробирку 50 мл. Заполните трубку с РВМСОМ до 50 мл с холодным PBS и центрифуги при 582 мкг в течение 10 мин. Удалить супернатант и дважды промывают холодным PBS и ресуспендируют в 1 мл PBS на 20 мл донорской крови, используемых на начальном этапе. Сделать 1:10 разведений для подсчета путем добавления 20 мкл клеточной суспензии в 160 мкл PBS и 20 мкл трипанового синего. Граф клеток с гемоцитометром. Подготовка буферного раствора путем добавления 26 мл инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки (FCS) и 2,1 мл 0,5 М ЭДТА до 500 мл HBSS. Центрифуга клетки в течение 10 мин при 515 мкг и ресуспендируют в 40 мкл буферного раствора на 1 × 10 7 клеток. Передача клеточной суспензии в 15 мл пробирку и добавляют 10 мкл CD14 микрошариков на 1 × 10 7 клеток, хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 мин при 4 ° С, убедившись , чтобы смешать трубки через каждые 5 мин. Вымойте клеток путем добавления 1 мл буферного раствора на 1 × 10 7 клеток и CENtrifuge при 515 мкг в течение 10 мин. Отберите супернатант полностью и ресуспендируют до 1 × 10 8 клеток в 500 мкл буферного раствора. Поместите 1 столбец за образец на магнитном сепараторе в соответствии с инструкциями изготовителя. Во-первых промывки колонки один раз с 500 мкл буферного раствора. Пипетки 500 мкл клеточной суспензии через колонку, подождите колонку, чтобы высушить и затем промыть, повторяя это три раза буферным раствором. Поместите новый 15 мл трубку под колонку и принять колонку от магнитного сепаратора. Затем промыть клетки из колонки в пробирку с 1 мл буферного раствора. Добавить 4 мл буферного раствора и центрифугируют при 515 х г в течение 10 мин, а затем ресуспендируют в 1 мл института Roswell Park Memorial (RPMI) среды. Сделать 1:10 разведений для подсчета путем добавления 20 мкл клеточной суспензии в 160 мкл PBS и 20 мкл трипанового синего. Количество клеток сгемоцитометр. Регулировка концентрации клеток до 6 × 10 5 / мл RPMI с и семян 200 мкл на чашку 35 мм изображения на основе стекла. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С с 5% CO 2. На следующий день, до обработки изображений, удалить RPMI и добавляют 200 мкл СО 2 независимой среды. Примечание: Эти моноциты также могут быть дифференцированы в различные макрофаги подмножества до визуализации. Если это метод , чтобы изучить, является отличной отправной точкой является недавней работе Ohradanova-Repic и др. 1 1. После уборки слоя РВМСА, удалить все сыворотки и большая часть раствора изоляции лимфоцитов, но быть осторожными, чтобы не удалить маленькую белую полосу на верхней часть красной таблетки, так как это будет содержать большую часть нейтрофилов. Подготовка 10x гипотонического буфера для лизиса запаса добавлением 83 г NH 4 Cl и 10 г КНСО 3 в 1 л стерильной воды. Хранить при 4 °C. Развести этот запас в 10 раз стерильной водой и добавить его в пробирки. Затем осторожно инвертировать 3 раза и инкубировать на льду в течение 15 мин. Центрифуга при 394 мкг в течение 10 мин и ресуспендируют в буфере для лизиса гипотонического в течение 10 мин во льду. Центрифуга при 394 мкг и дважды промывают холодным PBS. Ресуспендирует в 1 мл СО 2 независимой среды на донор. Сделать 1:10 разведений для подсчета путем добавления 20 мкл клеточной суспензии в 160 мкл PBS и 20 мкл трипанового синего. Граф клеток с гемоцитометром. Для проточной цитометрии, регулировать концентрацию до 6 × 10 5 / мл и добавляют суспензию 400 мкл клеток в 24-луночный планшет. Для микроскопии, добавить 200 мкл той же самой клеточной суспензии в чашку формирования изображения 35 мм на основе стекла. Примечание: визуализации или нейтрофилов проточной цитометрии должно быть начато немедленно из – за их склонность к апоптозу , если оставить нестимулированными. Если это невозможно, нейтрофилы должны храниться налед и использовать как можно скорее (в тот же день). 4. проточной цитометрии Добавляют 200 мкл 1,2 × 10 6 / мл FLARE конидий к клеткам в 24-луночного планшета, а затем добавить 100 мкл 20 мкг / мл вориконазола. Добавьте 300 мкл среды RPMI , и инкубируют в течение 16 ч при 37 ° С с 5% CO 2. Примечание: вориконазол добавляются для предотвращения конидий всхожести. Добавьте 25 мкл 1 мМ Calcofluor-белого исходного раствора в каждую лунку для конечной концентрации 25 мкМ и инкубируют в течение 10 мин при 37 ° С с 5% CO 2. Центрифуга при 582 мкг в течение 10 мин. Удалить супернатант и дважды промывают PBS. Для того, чтобы собрать прилипшие клетки (моноциты), добавляют 1 мл PBS с 3 мМ EDTA в каждую лунку и инкубировали в течение 10 мин при 37 ° С с 5% CO 2. Осторожно промыть клетки от пластины с помощью пипетки и собрать клетки в пробирке. Промыть один раз в FACS буфере (2% фетальной телячьей сыворотки, чтобы PBS), а затем ресуспендируют в FACS буфере для анализа FACS. Для анализа FACS, сначала необходимо настроить параметры компенсации на проточном цитометре и установить положительные ворота используя одноцветные компенсационные трубы, в том числе конидий, без цвета: DsRed + конидий, AF633 + конидий и Calcofluor белых + конидий (сгенерированная, как в 4.2). Освобожденные конидии затвор на основе вперед и боковое рассеивание, используя конидию без цвета. Набор клеток ворота по прямой и боковое рассеивание за счет исключения свободного конидий ворота. Анализ образца трубки путем записи 10000 событий. Примечание: Клетки, связанные с живыми конидий будут Dsred + и AF633 +. Клетки, связанные с мертвыми конидиями будут только AF633 +. Клетки Bystander, которые не занимаются конидии будет dsRed- и AF633-. В популяции клеток конидий зацепления дополнительно анализируется для Calcofluor White окрашивания на канале Pacific Blue. Конидии, которые остаются вне клетки будут Calcofluor White + и конидия, которые были усвоены будутCalcofluor Белый-. 5. Живая сотовый видеомикроскопия Примечание: Выбор микроскопа будет зависеть от того, что доступно локально, но установка микроскопа нужно будет включать в себя этап, инвертированный экологическую камеру, нагретую до 37 ° С и соответствующими фильтрами возбуждения / излучения для DsRed (532/561 нм) и AF633 (633 нм). FLARE конидии не работают с 488 нм лазер вместо этого 532/561 нм лазера для Dsred. При выполнении этого эксперимента для этого впервые, использовать контрольные конидии, без цвета и одного цвета, чтобы проверить на фоновую флуоресценцию и проступание между DsRed и AF633 каналами. Включите микроскоп нагреватель до начала эксперимента и обеспечить достаточное время для камеры контроля окружающей среды, чтобы нагреть до 37 ° С. Время, необходимое для температуры камеры для стабилизации будет изменяться для различных установок микроскопа. Включите микроскоп и компьютер, и вотобъявления программное обеспечение визуализации. Установите блюдо изображения на предметный столик микроскопа и настроить фокус, чтобы найти человека нейтрофилы или моноциты. Для Dsred и AF633, установите мощность лазера до 10% и выдержек времени до 1 с в настройках приобретения. Удалить слайд изображения и добавить 100 мкл 3 × 10 6 / мл ПИРОФАКЕЛА суспензии конидий в соответствующие лунки (общий объем 300 мкл / лунку). Запишите время, факельных конидии добавляют к блюду. Вернуть слайд на сцену и настроить чувствительность камеры для Dsred и AF633, чтобы ясно видеть конидии, но не передержать изображение. Настройка списка точек этапа, если требуются приобретение многоточечного. Начинают визуализации, когда все точки находятся в фокусе, каналы оптимизированы и время цикла и продолжительность устанавливаются. Время цикла и продолжительность визуализации зависит от экспериментального вопроса. Цель состоит в том, чтобы сохранить время цикла как можно более коротким (≤2 мин) с 1 мин позволяет в глубине анализа UPTдинамика. готовит в