に応答したヒト一次好中球及び単球による抗カビ活動のライブイメージング<em> A。フミガーツス</em

好中球および末梢血単核細胞（PBMC）を得るためのプロトコルは、以前公開された方法9に基づいています。健康なボランティアからの血液サンプルの使用は、アバディーン大学の人間研究倫理委員会によって承認されました。開始する前に、すべての倫理的な承認が記載される実験の目的のために健康なボランティアおよび/または患者から血液を描画するための場所であることを確認してください。彼らの生存を増加させることができる細胞を氷上に保管してください。 1. A. fumigatusの培養条件 10に記載されているようにグルコース最小寒天培地を調製します。 1 M NaOHを用いてpH6.5にメディアを調整し、20分間120℃でオートクレーブ。 65℃に冷却させます。 滅菌流フード中で作業し、T75フラスコに冷却媒体の30mLの流動およびC 25 mlピペットでフラスコ休止の首と冷却させます寒天斜面をreate。 寒天上のDsRed Af293- A.フミガーツス株アウトストリークし、37℃+ 5％CO 2で7日間インキュベートします。 2つのフラスコを、5 mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）プレビオチンに約10 9分生子をもたらします。 2. A.フミガーツスラベリング及び準備注：最初にこのアッセイを行う場合、親Af293- A.フミガーツス株を調製します。マイクロ遠心チューブ中の両方の株のサンプルを採取し、以下に説明するようにのみ各株のいずれかを標識します。これは、1つは、セットアップや機器をテストするために、DsRedのかAF633のいずれか、単一の色と色なしと分生子を制御分生子を持つことができるようになります。 30mLのPBS + 0.05％のTween-80で培養液を浸漬することにより収穫A.フミガーツス分生子。菌糸断片を除去するために、50mLのチューブに40μmのセルストレーナーを通して得られた懸濁液をフィルタリングします。 C10分間、805×gでentrifuge、上清を除去し、無菌PBS 20mlに1回洗浄。洗浄工程中の同系統の二つのプレートからのプール分生子。 洗浄工程後、マイクロ遠心チューブに5 mlのPBSと転送分生子懸濁液の1mLのアリコートでペレットを再懸濁します。各菌株の懸濁液の1mLを通常生細胞イメージングのために十分です。 4℃で箔とストア内の残りのアリコートを包みます。 分生子懸濁液の遠心分離アリコートを室温で10分間、9,300×gで、慎重に上清を除去します。 1 mLの0.05 M NaHCO 3をpHが8.3に分生子ペレットを再懸濁します。 500μLのDMSO中に25mgのビオチンを再構成することにより、10 mgのビオチン/ 200μLのジメチルスルホキシド（DMSO）ストック溶液を調製します。アルミホイルに10μLビオチン/マイクロ遠心チューブにDMSOストック溶液、カバーを追加し、4℃でロッカー上で2時間インキュベートします。 ビオチン/ DMSOストックsolutioの残りをアリコートnと、その後の実験で使用するために-20℃で凍結します。 9300×gで10分間遠心分離し、上清を注意深く取り除きます。自由浮動ビオチンを不活性化するために1時間、100mMのトリス-HCl pH8.0の1mLの分生子ペレットを再懸濁します。 9300×gで10分間遠心分離し、上清を注意深く取り除きます。滅菌PBS 1mLで二回ペレットを洗浄し、1mlのPBSにペレットを再懸濁します。 2mg / mLのストック溶液を作製するためにPBS 0.5mlのストレプトアビジン – AF633 1mgを溶解させます。分生子懸濁液1mlあたり2ミリグラム/ mLのストレプトアビジンAF633の10μLを加え、アルミホイルで覆われたロッカー上で室温で40分間インキュベートします。残りのストレプトアビジンAF633は、その後の実験で使用するための一定分量で凍結させることができます。 9300×gで10分間遠心分離し、上清を注意深く取り除きます。 PBS 1mLに分生子ペレットを再懸濁し、1で血球計数器を使用して、分生子をカウント：1,000希釈（1：100、その後1:10）。 CO 2独立培地で3.6×10分生子濃度6 / mLに調整し、4℃で箔とストアに包みます。 注：分生子は今AF633で標識されており、FLARE分生子と呼ぶことにします。 オプション：膨潤分生子による刺激が必要な場合、分生子（ステップ2.9）をカウントした後、酵母窒素塩基（YNB）培地中に7.2×10 6 / mLに分生子を希釈し、オートクレーブ50内に4.5 mLのYNB培地500μLを分生子懸濁液を追加mLの三角フラスコ。カバー6時間振盪インキュベーター（37℃、200 RPM）にフラスコを置きます。 15mLのチューブに培地を移します。室温で10分間、805×gで遠心分離し、PBS中で1回洗浄します。遠心分離機再度1mLのCO 2独立培地中でペレットを再懸濁し、3.6×10 6分生子/ mLに与えます。 注：分生子は頻繁に彼らは困難数え正確作る腫れになった後、Cで計算することをお勧めされて凝集使用分生子を休んのounted番号。 ヒト好中球および単球の3分離エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含む2本の10 mLの血液チューブに健康なボランティアから静脈血20mLのを描きます。別々に各ドナーのために、50 mLチューブに20mLの血液を注ぎ、15mLのPBSで希釈しました。 シリンジおよび鉄針とリンパ球分離溶液（密度1.077グラム/ mL）を15 mLの血液を下敷き。チューブの底に針を置き、穏やかにリンパ球分離溶液を押し出します。ブレーキなし、低加速度で20分間、630×gで遠心します。 PBS、氷上で冷却を準備します。 注：手順3.4と3.5は、単球（3.4）と好中球（3.5）を生成するために同時に従わなければなりません。 pastetteを使用して、PBMC層を収穫。これは、黄色血清（上部）と透明リンパ球分離溶液（下部）層との間の中央に層であり、そして新しい50mlチューブに移します。 10分間582×gで50冷PBSでmL及び遠心分離までPBMCでチューブを埋めます。上清を除去し、最初に使用されるドナー血液の20 1mLあたり1mlのPBSに再懸濁し、冷PBSとで二回洗浄します。 PBSの160μLのトリパンブルーの20μLの細胞懸濁液の20μLを添加することにより、カウント1:10希釈液を作ります。血球計数器を用いて細胞を数えます。 熱不活性化ウシ胎児血清（FCS）及びHBSS 500mLの0.5 M EDTAの2.1ミリリットルの26ミリリットルを添加することによって緩衝液を調製します。遠心分離機1×10 7個の細胞当たり緩衝液40μL中515×gで再懸濁で10分間細胞。 15mLのチューブに細胞懸濁液を移し、1×10 7細胞あたりのCD14マイクロビーズの10μLを追加し、よく混合し、5分毎のチューブを混合することを確認して、4℃で15分間インキュベートします。 1×10個の7細胞およびCEN当たり緩衝液1mlを添加することによって細胞を洗います10分間515×gでtrifuge。 吸引完全上清および緩衝液500μLに1×10 8細胞まで再懸濁します。 製造業者の指示に従って磁気分離にサンプル当たり1つのカラムを置き。第1緩衝溶液500μLで一度カラムを洗浄。 乾燥した後、緩衝液でこの3回繰り返して洗浄する列を待ち、カラムを通して細胞懸濁液500μLをピペット。 カラムの下に新しい15mLのチューブを配置し、磁気分離カラムオフを取ります。次いで、緩衝液1mLでチューブにカラムから細胞を洗い流します。 10分間、515×gで緩衝液及び遠心分離機の4 mLを加え、次いで、ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）培地1mLに再懸濁します。 PBSの160μLのトリパンブルーの20μLの細胞懸濁液の20μLを添加することにより、カウント1:10希釈液を作ります。で細胞を数えます血球計数器。 RPMI 6×10 5 / mlに細胞濃度を調整し、35mmのガラスベースのイメージング皿上に200μLを播種。 5％CO 2で37℃で一晩インキュベートします。 次の日、撮影に先立って、RPMIを除去し、CO 2独立培地200μLを加えます。 注：これらの単球も前に撮像種々マクロファージサブセットに分化させることができます。これは探求する手法であれば、優れた出発点はOhradanova-Repic らによる最近の論文です。 1 1。 PBMC層を採取した後、血清のすべてを削除し、リンパ球分離液のほとんどが、これは、好中球のほとんどが含まれていますよう赤ペレットの上に小さな白いバンドを削除しないように注意してください。 NH 4 Cl を 83gの滅菌水1LにKHCO 3 10gを添加することによって、10倍の低張溶解緩衝液ストックを調製します。 4℃で保存C. 滅菌水で、この株式の10倍に希釈し、チューブに追加します。その後、慎重に3回を反転し、15分間氷上でインキュベートします。 氷上で10分間低張溶解緩衝液中で10分間再懸濁のために394×gで遠心分離。 394×gで遠心分離し、冷たいPBSで2回洗浄します。ドナー当たりのCO 2独立培地1mLに再懸濁。 PBSの160μLのトリパンブルーの20μLの細胞懸濁液の20μLを添加することにより、カウント1:10希釈液を作ります。血球計数器を用いて細胞を数えます。 フローサイトメトリーのために、6×10 5 / mLの濃度に調整し、24ウェルプレートに400μLの細胞懸濁液を加えます。顕微鏡観察のために、35mmのガラスベースのイメージング皿に同一の細胞懸濁液200μLを加えます。 好中球イメージングのか、刺激されていない放置すればアポトーシスを受けるようにそれらの傾向に即座に開始すべきであるフローサイトメトリー：注意してください。これがない場合には可能性好中球が上に保持されなければなりません（同じ日以内に）できるだけ早く氷と使用。 4.フローサイトメトリー 24ウェルプレート中の細胞に1.2×10 6 / mLのFLARE分生子の200μLを追加し、20μgの/ mLのボリコナゾールの100μLを加えます。 RPMIの300μLを添加し、5％CO 2で37℃で16時間インキュベートします。 注：ボリコナゾールは、分生子発芽を防止するために添加されます。 25μMの最終濃度のために、各ウェルに1 mMのカルコフロアホワイト原液25μLを添加し、5％CO 2で37℃で10分間インキュベートします。 10分間582×gで遠心します。上清を除去し、PBSで2回洗浄します。 付着細胞（単球）を採取するために、各ウェルに3 mMのEDTAを含むPBS 1 mLを加え、5％CO 2で37℃で10分間インキュベートします。穏やかにピペッティングすることによってプレートから細胞を洗浄し、チューブ内の細胞を収集します。 PBにFACSバッファーで1回洗浄（2％ウシ胎児血清S）、その後、FACS分析のためにFACSバッファーに再懸濁します。 FACS分析のために、第一のフローサイトメーターの補償パラメータを調整しない色の分生子を含む単一色補償管を使用して正のゲート、設定：のDsRed +の分生子、AF633 +分生子、及びカルコフロアホワイト+分生子（4.2のように生成します）。 色のない分生子を使用して自由に前方に基づいて、分生子ゲートおよび側方散乱を設定します。無料の分生子ゲートを除くことにより、前方および側方散乱にセルのゲートを設定します。 万回のイベントを記録することにより、サンプルチューブを分析します。 注：ライブの分生子に関連した細胞は、+のDsRedとAF633 +されます。死んだ分生子に関連した細胞は、唯一のAF633 +となります。分生子を従事していないバイスタンダー細胞はdsRed-とAF633-になります。分生子合さ細胞集団は、さらに、パシフィックブルーチャネルでカルコフロアホワイト染色について分析します。内在化されていカルコフロアホワイト+になり、細胞の外に残っている分生子、分生子は次のようになりますカルコフロア白 – 。 5.ライブセルビデオ顕微鏡注：顕微鏡の選択は局所的に利用可能なものに依存するが、顕微鏡の設定は反転ステージ、37°C​​とのDsRed（561分の532 nm）をAF633に適切な励起/発光フィルターに加熱し、環境チャンバを含める必要があります（633nmで）。 FLARE分生子はDsRedのための561分の532 nmのレーザーの代わりに488nmのレーザーでは動作しません。この最初に、この実験を行う際に、バックグラウンド蛍光について試験し、ブリードスルーのDsRedとAF633チャネルとの間には、no色および単色で制御分生子を使用します。 実験前に、顕微鏡ヒーターの電源をオンにし、環境制御室のための十分な時間が37°Cまで昇温することができます。安定化させるために、チャンバ温度に要する時間が異なる顕微鏡セットアップのために変化するであろう。 顕微鏡とコンピュータの電源を入れ、LO広告イメージングソフトウェア。顕微鏡ステージ上の撮像皿をマウントし、ヒト好中球または単球を見つけるために焦点を合わせます。 DsRedとAF633ため、取得設定で1秒に10％と露光時間にレーザパワーを設定します。 撮像スライドを削除し、適切なウェル（総容量300μL/ウェル）に3×10 6 / mLのFLARE分生子懸濁液100μLを加えます。分生子は皿に添加されているFLARE時間を記録します。 ステージにスライドを戻し、明確に分生子を参照してくださいが、イメージを露出オーバーしないようにのDsRedとAF633用カメラの感度を調整します。マルチポイント取得が必要な場合は、ステージポイントのリストを設定します。 全ての点が焦点にあるとき、チャネルが最適化され、サイクル時間および持続時間が設定された撮像開始。サイクルタイムとイメージングの期間は、実験的な質問に依存します。目標は1分UPTの深さの分析を可能にするとともに、できるだけ短いサイクルタイム（≤2分）維持することですダイナミクスAKE。