Imagens ao vivo de antifúngicos Atividade por neutrófilos humanos primários e monócitos em resposta à<em> A. fumigatus</em

O protocolo para a obtenção de neutrófilos e células mononucleares de sangue periférico (PBMC) é baseada em métodos publicados anteriormente 9. O uso de amostras de sangue de voluntários saudáveis ​​foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa humana da Universidade de Aberdeen. Antes de começar certifique-se todas as aprovações éticas estão no local para a retirada de sangue de voluntários saudáveis ​​e / ou pacientes com a finalidade do experimento descrito. Manter as células no gelo sempre que possível para aumentar a sua sobrevivência. 1. A. fumigatus Cultura e Condições Prepare meio de ágar mínimo de glucose tal como descrito 10. Ajustar meios para pH 6,5 usando NaOH 1 M e autoclave a 120 ° C durante 20 min. Deixa-se arrefecer para 65 ° C. Trabalhando numa cara de fluxo estéril, verter 30 mL de meio arrefecido em um frasco T75 e deixa-se arrefecer com o gargalo do frasco que descansa sobre uma pipeta de 25 ml a create uma inclinação agar. Streak a dsRed Af293- estirpe de A. fumigatus no agar e incubar durante 7 dias a 37 ° C + 5% de CO 2. Dois frascos irá produzir cerca de 10 9 conídios em 5 mL de solução salina de fosfato tamponada (PBS) pré-biotinilação. 2. A. fumigatus e Rotulagem Preparação Nota: Ao realizar este ensaio, pela primeira vez, preparar o parental Af293- estirpe de A. fumigatus. Retirar amostras de ambas as estirpes em tubos de microcentrífuga e etiquetar apenas um de cada estirpe, como descrito abaixo. Isso permitirá que se tenha conídios controle sem cor e conídios com uma única cor, ou dsRed ou AF633, para testar a configuração e equipamentos. Colheita A. fumigatus conidia por imersão da cultura com 30 mL de PBS + 0,05% Tween-80. Filtra-se a suspensão resultante através de um filtro celular de 40? M para um tubo de 50 mL para remover fragmentos de hifas. Centrifuge a 805 xg durante 10 min, remover o sobrenadante e lava-se uma vez em 20 ml de PBS estéril. conídios piscina a partir de duas placas da mesma estirpe durante o passo de lavagem. Seguindo o passo de lavagem, ressuspender o sedimento em 5 mL de PBS e de transferência de alíquotas de 1 ml de suspensão de conídios em tubos de microcentrífuga. 1 ml de suspensão de cada estirpe é geralmente suficiente para a imagem de células vivas. Enrole as alíquotas restantes na folha e armazenar a 4 ° C. alíquotas de centrífuga de suspensão de conídios a 9300 xg durante 10 min à temperatura ambiente e cuidadosamente remover o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 1 mL de conídios 0,05 M de NaHCO3, pH 8,3. Preparar 10 mg biotina / 200 mL de dimetilsulfóxido solução estoque (DMSO) através da reconstituição de 25 mg de biotina em 500 uL de DMSO. Adicionar 10 uL de biotina / solução de estoque de DMSO ao tubo de microcentruga, a cobertura em folha de alumínio e incuba-se durante 2 horas num agitador rotativo a 4 ° C. Alíquota o restante da biotina / DMSO estoque solution e congelar a -20 ° C para utilização em experiências subsequentes. Centrifugar durante 10 minutos a 9300 xg e remover cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspender o sedimento de conídios em 1 mL de Tris-HCl pH 8,0 100 durante 1 h para desactivar biotina livre flutuação. Centrifugar durante 10 minutos a 9300 xg e remover cuidadosamente o sobrenadante. Lava-se a pelete duas vezes com 1 mL de PBS estéril e ressuspender o sedimento em 1 mL de PBS. Dissolve-se 1 mg de estreptavidina-AF633 em 0,5 mL de PBS para fazer uma solução estoque a 2 mg / mL. Adicionar 10 ul de 2 mg / mL de estreptavidina-AF633 por 1 ml de suspensão de conídios e incubar durante 40 min à temperatura ambiente num agitador rotativo coberto de folha de alumínio. O restante Estreptavidina-AF633 pode ser congelada em alíquotas para utilização em experiências subsequentes. Centrifugar durante 10 minutos a 9300 xg e remover cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspender o sedimento de conídios em 1 mL de PBS e contar os conídios usando um hemocitómetro a uma diluição de 1: 1000 (1: 100 e, em seguida, 01:10). Ajustar a concentração de conídios de 3,6 x 10 6 / mL com CO2 meios independentes, enrole em tiras e armazenar a 4 ° C. NOTA: Os conídios são agora rotulados com AF633 e será referido como conídios FLARE. Opcional: Se é necessária a estimulação com conídios inchado, após a contagem de conídios (passo 2.9), dilui-se conídios de 7,2 x 10 6 / mL em base de azoto de levedura meio (YNB) e adicionar 500 uL de suspensão de conídios de 4,5 ml de meio YNB em um autoclave 50 mL Erlenmeyer. Cobrir e colocar o balão em um incubador com agitação (200 rpm a 37 ° C) durante 6 h. Transferir o meio para um tubo de 15 mL. Centrifugar a 805 xg durante 10 min à temperatura ambiente e lava-se uma vez em PBS. Centrifugar novamente e ressuspender o pellet em 1 ml de CO 2 forma independente, dando 3,6 x 10 6 conídios / ml. Nota: Os conídios frequentemente aglutinar depois que se tornam inchados fazendo preciso contar difícil, é aconselhável para calcular com o counted números de conídios descansando utilizados. 3. Isolamento de neutrófilos humanos, e monócitos Desenhar 20 ml de sangue venoso de voluntários saudáveis ​​em dois tubos de 10 mL de sangue, contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Para cada doador separadamente, verter 20 mL de sangue em um tubo de 50 ml e dilui-se com 15 mL de PBS. Subjazia o sangue com 15 mL de uma solução de isolamento de linfócitos (densidade 1,077 g / mL) com uma agulha de seringa e ferro. Coloque a agulha na parte inferior do tubo e suavemente forçar a solução de isolamento de linfócitos para fora. Centrifugar a 630 xg durante 20 min sem travão e baixo aceleração. Prepare PBS, arrefecidas em gelo. NOTA: As etapas 3,4 e 3.5 devem ser seguidos simultaneamente para gerar monócitos (3.4) e (3.5) neutrófilos. Usando um pastette, colher a camada de PBMC. Esta é a camada no centro entre o soro amarelo (superior) e a solução transparente isolamento dos linfócitos camada (inferior), etransferir para um tubo de 50 ml fresco. Encher o tubo com o PBMC até 50 mL com PBS frio e centrifugar a 582 xg durante 10 min. Remover o sobrenadante e lava-se duas vezes com PBS frio e ressuspender em 1 ml de PBS por 20 ml de sangue de doadores utilizados inicialmente. Fazer diluições 1:10 para contagem por adição de 20 uL da suspensão de células a 160 ul de PBS e 20 uL de azul de tripano. Contar as células com um hemocitómetro. Prepara-se uma solução tampão por adição de 26 ml de soro inactivado por calor de vitelo fetal (FCS) e 2,1 mL de EDTA 0,5 M a 500 ml de HBSS. Centrifugar as células durante 10 min a 515 x g e ressuspender em 40 ul de solução tampão por 1 x 10 7 culas. Transferir a suspens celular para um tubo de 15 mL e adicionar 10 ul de microesferas de CD14 por 1 x 10 7 culas, misturar bem e incubar durante 15 min a 4 ° C, certificando-se de misturar os tubos a cada 5 min. Lave as células por adição de 1 mL de solução tampão por 1 x 10 7 culas e centrifuge a 515 xg durante 10 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender completamente até 1 x 10 8 culas em 500 uL de solução tampão. Coloque 1 coluna por amostra em um separador magnético de acordo com as instruções do fabricante. Primeiro lava-se a coluna uma vez com 500 uL de solução tampão. Pipetar 500 uL de suspensão de células através da coluna, esperar para a coluna secar e em seguida lavar, repetindo esta três vezes com solução tampão. Colocar um novo tubo de 15 mL por baixo da coluna e levar a coluna fora do separador magnético. Em seguida, lavar as células para fora da coluna dentro do tubo com 1 mL de solução tampão. Adicionar 4 ml de solução tampão e centrifugar a 515 xg durante 10 min, e em seguida ressuspender em 1 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) médio. Fazer diluições 1:10 para contagem por adição de 20 uL da suspensão de células a 160 ul de PBS e 20 uL de azul de tripano. Contar as células com umhemocitômetro. Ajustar a concentração de células de 6 x 10 5 / ml com RPMI e semear 200 mL num prato de imagiologia à base de vidro de 35 mm. Incubar durante a noite a 37 ° C com 5% de CO 2. No dia seguinte, antes da imagem, remover o meio RPMI e adicionar 200 uL de CO 2 forma independente. Nota: Estes monócitos também podem ser diferenciadas em vários subconjuntos de macrófagos antes da imagiologia. Se esta é uma técnica a ser explorada, é um excelente ponto de partida é o artigo recente de Ohradanova-Repic et al. 1 1. Após a colheita da camada de PBMC, remover todo o soro e a maior parte da solução de isolamento de linfócitos, mas ter cuidado para não remover a pequena faixa branca no topo do sedimento vermelho como esta irá conter a maior parte dos neutrófilos. Preparar um estoque de tampão 10x hipotónico a lise por adição de 83 g de NH4Cl e 10 g de KHCO3 em 1 L de água estéril. Armazenar a 4 °C. Diluir esta 10x estoque com água estéril e adicioná-lo aos tubos. Em seguida, inverter cuidadosamente 3 vezes e incubar em gelo durante 15 min. Centrifugar a 394 xg durante 10 min e ressuspender em tampão de lise hipotónico durante 10 min em gelo. Centrifugar a 394 xg e lavar duas vezes com PBS frio. Ressuspender em 1 ml de CO 2 forma independente por doador. Fazer diluições 1:10 para contagem por adição de 20 uL da suspensão de células a 160 ul de PBS e 20 uL de azul de tripano. Contar as células com um hemocitómetro. Por citometria de fluxo, para ajustar a concentração de 6 x 10 5 / ml e adicionar a suspensão de células de 400 ul de uma placa de 24 poços. Para a microscopia, adicionar 200 uL da mesma suspensão de células para uma placa de imagiologia à base de vidro de 35 mm. Nota: imagiologia de Neutrófilos ou citometria de fluxo deve ser iniciado imediatamente devido à sua propensão para sofrer apoptose, se não estimuladas. Se isso não for possível neutrófilos deve ser mantido emgelo e utilizadas o mais rapidamente possível (dentro de um mesmo dia). 4. Citometria de Fluxo Adicionar 200 ul de 1,2 x 10 6 / mL conídios ALARGAMENTO para as células na placa de 24 poços, e, em seguida, adiciona-se 100 mL de 20 ug / mL de voriconazol. Adicionar 300 uL de meio RPMI e incubados durante 16 h a 37 ° C com 5% de CO 2. NOTA: O voriconazol é adicionado para evitar a germinação de conídios. Adicionam-se 25 uL de uma solução de estoque 1 mM Calcofluor-branco para cada poço para uma concentração final de 25 uM e incubar durante 10 min a 37 ° C com 5% de CO 2. Centrifugar a 582 xg durante 10 min. Remover o sobrenadante e lava-se duas vezes com PBS. Para colher as células aderentes (monócitos), adicionar 1 ml de PBS com EDTA a 3 mM a cada poço e incubar durante 10 min a 37 ° C com 5% de CO 2. Com cuidado, lavar as células para fora da placa por pipetagem e recolher células em um tubo. Lavar uma vez em tampão de FACS (soro de vitelo fetal a 2% a PBS), e em seguida ressuspender em tampão FACS para análise de FACS. Para a análise FACS, primeiro ajustar os parâmetros de compensação do citetro de fluxo e configurado portões positivos usando tubos de compensação de cor única, incluindo conídios sem cor: dsRed + conídios, AF633 + conídios, e Calcofluor Branco + conídios (gerado como em 4.2). Definir porta conídios livre com base em dispersão frontal e lateral usando conídios sem cor. Definir porta célula em dispersão frontal e lateral, excluindo a porta conídios livre. Analisar tubo de amostra através da gravação de 10.000 eventos. NOTA: As células associadas com conídios ao vivo será dsRed + e AF633 +. Células associadas com conídios morto será apenas AF633 +. células espectador que não se envolveram conídios será dsRed- e AF633-. As populações de células envolvidos-conídios são ainda analisados ​​por coloração com Calcofluor branco no canal azul do Pacífico. Conídios que permanecem fora das células será calcofluor Branco +, e conídios que foram internalizados seráCalcofluor White-. 5. celular Vivo Vídeo Microscopy Nota: A escolha de microscópio dependerá do que estiver disponível localmente, mas a configuração microscópio terá de incluir uma fase invertida, uma câmara ambiental aquecida a 37 ° C e os filtros de excitação / emissão adequados para dsRed (532/561 nm) e AF633 (633 nm). conídios FLARE não funcionam com o laser de 488 nm, em vez do laser 532/561 nm para dsRed. Ao realizar esta experiência para esta primeira vez, utilizar os conídios de controlo sem cor e de cor única para testar para a fluorescência de fundo e a infiltração entre a dsRed e canais AF633. Ligar o aquecedor do microscópio antes da experiência e permitir tempo suficiente para a câmara de controlo do ambiente para aquecer a 37 ° C. O tempo necessário para estabilizar a temperatura da câmara para variará para diferentes configurações do microscópio. Ligue o microscópio e computador, e eisanúncio do software de imagem. Monte o prato de imagem no palco microscópio e ajustar o foco para encontrar os neutrófilos ou monócitos humanos. Para dsRed e AF633, defina a potência do laser para 10% e tempo de exposição a 1 s nas configurações de aquisição. Remover o slide de imagem e adicionar 100 uL de 3 x 10 6 / mL de suspensão de conídios ALARGAMENTO aos poços apropriados (volume total de 300 ul / poço). Anote o tempo que se alargam conídios são adicionados ao prato. Devolver o slide para o palco e ajustar a sensibilidade da câmera para dsRed e AF633 para ver claramente os conídios, mas não expor demais a imagem. Configurar uma lista de pontos de estágio se a aquisição multi-ponto é necessária. Comece imaginando quando todos os pontos estão em foco, os canais são otimizados e o tempo de ciclo e duração está definida. O tempo de ciclo e a duração da imagem depende da questão experimental. O objectivo é manter o tempo de ciclo tão curto quanto possível (≤2 min) com um min permitindo uma análise em profundidade de UPTdinâmica ake.