Nous décrivons ici un protocole pour évaluer l' activité antifongique des cellules immunitaires humaines primaires en temps réel en utilisant fluorescent Aspergillus reporter conidies conjointement avec la microscopie vidéo en direct de cellules et cytométrie de flux. Les données obtenues permettent de mieux comprendre les interactions Aspergillus niger hôtes telles que l' activité fongicide, la phagocytose, la migration cellulaire et l' inhibition de la croissance fongique.
Aspergillus fumigatus est un champignon pathogène opportuniste causant des infections invasives chez les hôtes immunodéprimés avec un fort taux de létalité. Recherche portant sur les réponses immunologiques contre A. fumigatus a été limitée par l'absence d'analyses cohérentes et fiables pour mesurer l'activité antifongique des cellules immunitaires spécifiques in vitro. Une nouvelle méthode est décrite pour évaluer l'activité antifongique des monocytes et des neutrophiles primaires provenant de donneurs humains contre A. fumigatus utilisant Aspergillus fluorescent rapporteur (FLARE) conidies. Ces conidies contiennent un reporter DsRed génétiquement codé, qui est exprimée de manière constitutive par les conidies en direct FLARE et sont à l' extérieur marqué avec Alexa Fluor 633, qui est résistant à la dégradation à l'intérieur du phagolysosome, permettant ainsi une distinction entre vivants et morts A. fumigatus conidies. microscopie vidéo et cytométrie de flux sont ensuite utilisés pour visualiser la Interagirion entre conidies et les cellules immunitaires innées, l'évaluation de l'activité fongicide tout en fournissant également une mine d'informations sur la migration des phagocytes, la phagocytose et l'inhibition de la croissance fongique. Cette nouvelle technique a déjà fourni de nouvelles informations passionnantes sur l'interaction hôte-pathogène des cellules immunitaires primaires contre A. fumigatus. Il est important de noter la configuration de laboratoire requis pour effectuer cette analyse, y compris la microscopie nécessaire et cytométrie de flux des installations, et la capacité de travailler avec du sang de donneurs humains et les champignons génétiquement modifiés. Cependant, cet essai est capable de générer de grandes quantités de données et peut révéler un aperçu détaillé dans la réponse antifongique. Ce protocole a été utilisé avec succès pour étudier l'interaction hôte-pathogène des cellules immunitaires primaires contre A. fumigatus.
Il est important de noter la configuration de laboratoire requis pour effectuer cette analyse, y compris la microscopie nécessaire et cytométrie de flux facilities et la capacité de travailler avec le sang des donneurs humains et les champignons génétiquement modifiés. Cependant, cet essai est capable de générer de grandes quantités de données et peut révéler un aperçu détaillé dans la réponse antifongique. Ce protocole a été utilisé avec succès pour étudier l'interaction hôte-pathogène des cellules immunitaires primaires contre A. fumigatus.
Aspergillus fumigatus est un champignon pathogène opportuniste et la cause fongique la plus courante des infections pulmonaires invasives chez l'hôte immunodéprimé 1, 2. Comprendre comment les cellules immunitaires hôtes reconnaissent et éliminent Aspergillus est un domaine important de la recherche fongique, cependant, les tests actuellement disponibles parasiticides ont des limites importantes. Les méthodes couramment utilisées pour mesurer l' activité fongicide comprennent les dosages colorimétriques et détermination des unités formant des colonies 3, 4. Cependant, ces méthodes fournissent des informations sur la viabilité des champignons à un seul point du temps plutôt que de considérer l'interaction dynamique entre l'hôte et l'agent pathogène. Par conséquent, ces méthodes ne peuvent pas prendre en compte si un champignon a été tué ou simplement (temporairement) restreint la croissance ou l'activité métabolique. Nous avons mis au point une méthode capable d'observer fungiciactivité dal directement tout en capturant simultanément des informations détaillées sur la phagocytose, la migration des phagocytes et l'inhibition de la croissance fongique.
Auparavant, un protocole a été publié en utilisant l' imagerie en temps réel comme un moyen pour mesurer la phagocytose de Candida albicans par une lignée cellulaire de macrophages de souris 5. Ce concept a été développé plus pour combler le déficit de connaissances dans notre compréhension des interactions avec les cellules immunitaires Aspergillus en utilisant FLUORESCENT Aspergillus REPORTER (FLARE) conidies 6, 7, 8. Ces conidies expriment un fluorochrome rouge (DsRed) et sont marquées avec un second fluorophore (Alexa Fluor 633). Une fois qu'une conidie FLARE est tué, il cesse de produire DsRed et la DsRed restants fondus, tandis que le reste AF633 fluorescent et lié à la conidies. Cela crée une distinction claire entre fu morts et vivantscellules NGAL lors de l'imagerie de cellules vivantes et cytométrie de flux, et permet le suivi du sort des conidies individuels après leur interaction avec les cellules immunitaires.
Les essais décrits fournissent une méthode efficace de visualiser l'interaction entre les cellules immunitaires hôtes et Aspergillus et seront d' une valeur considérable dans le décryptage des voies de signalisation cellulaires responsables de mécanismes effecteurs antifongiques dans les cellules immunitaires innées. D' autres applications comprennent la visualisation de la façon dont les changements dans la croissance d' Aspergillus, tels que le passage de repos à conidies gonflé, ou de conidies gonflés à hyphes, affectent la reconnaissance des phagocytes et la fonction.
Le protocole suivant décrit en détail comment obtenir des monocytes humains et des neutrophiles; la façon de préparer la FLARE conidies; et comment capturer leurs réponses avec la microscopie vidéo et cytométrie de flux. Bien que l'utilisation de cellules immunitaires humaines isolées à partir du sang de donneur est décrit ici, cettetechnique a fait ses preuves tout aussi efficace en utilisant une variété de populations de cellules murines.
Cette méthode décrit une méthode novatrice dans in vitro pour étudier l'activité antifongique des phagocytes humains primaires contre A. fumigatus utilisant Aspergillus fluorescent rapporteur (FLARE) conidies, imagerie des cellules vivantes et cytométrie de flux. Des études antérieures ont démontré la valeur ajoutée de l' utilisation conidies FLARE in vivo dans une infection fongique expérimentale murine et dans l' évaluation in vitro de l' immunité antifongique 6, 7. La combinaison de FLARE conidies avec cette nouvelle génération en temps réel technique d'imagerie cellulaire permet une installation pour mesurer la viabilité des conidies individuelle au cours des interactions dynamiques in vitro.
La méthode décrite a le potentiel d'enquêter sur les rôles et l'importance de certains processus cellulaires de cellules immunitaires sur leurs réponses anti-fongiques. En outre, les réponses anti-fongiques de phagocytes de patients spécifiques souffrant desimples défauts de composants définies dans le système immunitaire peut être évaluée de façon plus détaillée. Très tôt et les réponses initiales antifongiques peuvent être étudiés en détail plus de 6 h d'imagerie continue. Cela permet même des différences subtiles à détecter, telles que la vitesse de migration des phagocytes vers le champignon, les taux d'intériorisation, la dynamique des événements 12 parasiticides, qui seraient indiscernables en utilisant des méthodes de phagocytose conventionnelles.
Tout type de cellule peut être utilisée avec cette méthode; les types cellulaires utilisés ici ont été choisis parce que ces phagocytes constituent les première et deuxième lignes de défense dans les voies respiratoires humaines contre A. fumigatus 13. Fait intéressant, on observe des différences très claires entre la façon dont les monocytes et les neutrophiles engagent des aires de repos et conidies enflé et hyphes. Monocytes migrent à peine conidies, tandis que les neutrophiles présentent une activité beaucoup plus migratoire. mar fluorescent supplémentairekers tels que des marqueurs vivants morts sur les cellules immunitaires peuvent être inclus dans l'essai pour fournir des indications sur la survie des phagocytes suivant interactions avec Aspergillus. Des applications intéressantes futures potentielles de cette technologie comprennent la co-culture de différents types de cellules hôtes, les conséquences pour les réponses antifongiques (par exemple, les macrophages sur une monocouche épithéliale, les cellules dendritiques dérivées de monocytes ensemble avec neutrophiles), et la mesure en temps réel de réactif production d' oxygène de l' espèce ou des neutrophiles formation de piège extracellulaire après stimulation par Aspergillus.
Quelques points doivent être notés pour utiliser ce protocole, avant tout de l'installation de laboratoire requis: un microscope avec une phase inversée, une chambre environnementale stable à 37 ° C, et l'excitation / filtres d'émission pour DsRed (532/561 nm) et AF633 ( 633 nm). La capacité du microscope pour maintenir les cellules en mise au point et à conserver l'immersion dans l'huile (particulièrement pertinente au cours de macquisition ulti point) doit être contrôlée périodiquement en raison de la longue durée de l'imagerie. Pour la quantification de l'activité parasiticides installations cytométrie de flux sont nécessaires. En outre, les approbations institutionnelles et éthiques appropriées doivent être mises en place pour travailler avec donneur sain et des échantillons de sang provenant de patients et les champignons génétiquement modifiés. Il est fortement recommandé d'utiliser des échantillons de sang frais (utilisation le même jour) pour augmenter la viabilité des cellules et de préserver la fonctionnalité. Idéalement, l'isolement des cellules est effectuée immédiatement après l'étirage des échantillons de sang et les neutrophiles sont imagés immédiatement après l'isolement.
En conclusion, une nouvelle génération technique d'imagerie de cellules vivantes pour évaluer en détail l' activité antifongique phagocytaire contre A. fumigatus est décrit. Cette technologie peut fournir un aperçu unique sur les interactions cellulaires fongiques individuelles dans les premières défenses immunitaires innées contre Aspergillus.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par la MRC et l'Université d'Aberdeen (MRC Centre de Mycologie Médicale) et par le Prix stratégique Wellcome Trust – mycologie médicale Fungal Immunologie (SFB, JMB, JK, AW). Un grand merci est donnée au soutien du Fonds Chloe. TMH est soutenu par une subvention de l'Institut national de la santé (NIH, le code RO1 093808) et le Memorial Sloan Kettering Cancer Center est soutenu par des subventions du NIH CA008748 P30. De plus, TMH est un enquêteur dans la pathogénie des maladies infectieuses soutenu par le Fonds Burroughs Wellcome. Nous tenons à remercier le Microscopie Aberdeen et Facility Histologie pour leur aide et leur soutien.
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BD LSRII | BD Biosciences | Flowcytometer used. https://www.bdbiosciences.com/ |