הדמיה חיה של פעילות אנטי פטרייתי על ידי אדם מן המעלה הראשונה נויטרופילים ומונוציטים בתגובה<em> A. fumigatus</em

הפרוטוקול לקבלת נויטרופילים ותאי דם היקפי mononuclear (PBMC) מבוסס על שיטות שפורסמו בעבר 9. השימוש דגימות דם ממתנדבים בריאים אושרה על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבני אדם מאוניברסיטת אברדין. לפני שמתחילים לוודא שכל האישורים האתיים נמצאים במקום לציור דם ממתנדבים בריאים ו / או חולים לצורך הניסוי המתואר. שמור את התאים על הקרח שבו ניתן להגדיל את הישרדותם. תרבות והגבלות 1. א fumigatus כן גלוקוז הבינוני אגרו מינימאלית כמתואר 10. התאם מדיה ל- pH 6.5 באמצעות 1 M NaOH החיטוי ב 120 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. אפשר לקרר כדי 65 מעלות צלזיוס. עבודה במנדף זרימה סטרילי, לשפוך 30 מ"ל של התקשורת מקורר לתוך בקבוק T75 להתקרר עם הצוואר השראת הבקבוק על פיפטה 25 מ"ל ל גreate מדרון אגר. Streak את זן א fumigatus dsRed Af293- על אגר דגירה במשך 7 ימים על 37 ° C + 5% CO 2. שתי צלוחיות תניב כ 10 9 נבגים ב 5 מ"ל פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) טרום biotinylation. 2. א fumigatus תיוג והכנה הערה: בעת ביצוע assay זה בפעם הראשונה, להכין את זן א fumigatus Af293- ההורי. קח דגימות של שני זני צינורות microcentrifuge ותייגת רק אחת מכל זן כמתואר להלן. זה יאפשר לקיים אחת נבגים מלאים ללא צבע נבגים עם צבע אחד, או dsRed או AF633, בדיקת ההתקנה והציוד. קציר fumigatus א נבגים ידי טבילה תרבות עם 30 מ"ל PBS + 0.05% Tween-80. סנן את ההשעיה וכתוצאה דרך מסננת תא 40 מיקרומטר לתוך צינור 50 מ"ל להסיר שברי hyphal. גentrifuge ב 805 XG במשך 10 דקות, להסיר את supernatant ולשטוף פעם 20 מ"ל של PBS סטרילית. ברכת נבגים משתי צלחות מאותו הזן במהלך השלב לשטוף. בעקבות הצעד כביסה, resuspend גלולה ב 5 מ"ל של PBS והעברה 1 aliquots מ"ל של השעיה הנבגים לתוך צינורות microcentrifuge. 1 מ"ל של השעיה של כל זן הוא בדרך כלל מספיק עבור הדמיה תא חי. עוטפים את aliquots הנותרים בנייר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. aliquots צנטריפוגה ההשעיה הנבגים ב 9300 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בזהירות להסיר supernatant. Resuspend גלולה הנבגים ב 1 מ"ל 0.05 M NaHCO 3 pH 8.3. הכן 10 מ"ג ביוטין / 200 μL dimethylsulfoxide (DMSO) פתרון המניות על ידי reconstituting ביוטין 25 מ"ג ב 500 μL DMSO. להוסיף 10 μL ביוטין / פתרון מניות DMSO אל צינור microcentrifuge, כיסוי בנייר אלומיניום דגירה במשך 2 h על כיסא נדנדה ב 4 ° C.. Aliquot שאר solutio המניות ביוטין / DMSOn ולהקפיא ב -20 ° C לשימוש בניסויים הבאים. צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 9300 XG ובזהירות להסיר את supernatant. Resuspend גלולה הנבגים ב 1 מ"ל של 100 מ"מ טריס-HCl pH 8.0 עבור 1 h כדי לבטל ביוטין "פנויות". צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 9300 XG ובזהירות להסיר את supernatant. שטפו את הכדור פעמיים עם 1 מ"ל של PBS סטרילי מחדש להשעות גלולה ב 1 מ"ל של PBS. ממיסים 1 מ"ג של streptavidin-AF633 ב 0.5 מ"ל של PBS לבצע פתרון המניות 2 מ"ג / מ"ל. להוסיף 10 μL של 2 מ"ג / מ"ל ​​streptavidin-AF633 לכל 1 מ"ל של השעיה הנבגים דגירה במשך 40 דקות בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה מכוסה בנייר אלומיניום. Streptavidin-AF633 הנותרים ניתן קפוא aliquots לשימוש בניסויים הבאים. צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 9300 XG ולהסיר supernatant בזהירות. Resuspend גלולה הנבגים ב 1 מ"ל של PBS ולספור את נבגים באמצעות hemocytometer בבית 1: דילול 1000 (1: 100 ולאחר מכן 01:10). התאם את ריכוז הנבגים כדי 3.6 x 10 6 / מ"ל עם CO 2 תקשורת עצמאית, עוטפים בנייר כסף ולאחסן ב 4 °. הערה: הנבגים עכשיו מסומן עם AF633 ויהיה המכונים התלקחות נבגים. אופציונלי: אם גירוי עם נפוחות נבגים נדרש, לאחר ספירת נבגים (שלב 2.9), לדלל נבגים כדי 7.2 x 10 6 / מ"ל ב בסיס שמרים חנקן (YNB) בינוני ומוסיפים 500 μL ההשעיה הנבגים כדי 4.5 בינוני מ"ל YNB בתוך autoclaved 50 מיליליטר Erlenmeyer בקבוק. מכסים ומניחים את הבקבוק בתוך חממה רועדת (200 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס) במשך 6 שעות. העבר המדיום לצינור 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 805 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף פעם PBS. צנטריפוגה שוב גלולה גלולה ב 1 מ"ל CO 2 בינוני עצמאי, נותן 3.6 x 10 6 נבגים / מ"ל. הערה: נבגי גוש קרוב לאחר שהם להתבטבט ביצוע מדויק לספור קשה, מומלץ לחשב עם גמספרי ounted של נח נבגים בשימוש. 3. בידוד של נויטרופילים אדם מונוציטים צייר 20 מ"ל של דם ורידי ממתנדבים בריאים לשתי צינורות הדם 10 מ"ל המכיל חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA). עבור כל התורם בנפרד, לשפוך דם 20 מ"ל בתוך שפופרת 50 מ"ל ו לדלל עם 15 מ"ל PBS. ביסוד דם עם 15 מ"ל של פתרון בידוד הלימפוציטים (צפיפות 1.077 גרם / מ"ל) עם מחט מזרק וברזל. מניחים את המחט בתחתית הצינור בעדינות לכפות פתרון בידוד הלימפוציטים החוצה. צנטריפוגה ב 630 XG במשך 20 דקות ללא בלם והאצה נמוכה. כן PBS, מקורר על קרח. הערה: שלבי 3.4 ו 3.5 חייב להיות מלווה בעת ובעונה אחת כדי ליצור מונוציטים (3.4) ו נויטרופילים (3.5). באמצעות pastette, לקצור את השכבה PBMC. זוהי השכבה במרכז בין הסרום הצהוב (העליון) ופתרון בידוד הלימפוציטים השקוף השכבה (נמוכה), וולהעביר לתוך צינור 50 מ"ל טרי. מלאו את צינור עם PBMC עד 50 מ"ל עם PBS צנטריפוגות קר בבית 582 XG במשך 10 דקות. הסר את supernatant ולשטוף פעמיים עם קר PBS ו resuspend 1 מ"ל של PBS לכל 20 מ"ל של דם התורם השתמשו בתחילה. הפוך 01:10 דילולים עבור לספור על ידי הוספת 20 μL של השעיה תא 160 μL של PBS ו 20 μL של trypan כחול. ספירת תאים עם hemocytometer. הכן פתרון חיץ על ידי הוספת 26 מ"ל של סרום העובר עגל חום מומת (FCS) ו 2.1 מ"ל של 0.5 M EDTA כדי 500 מ"ל של HBSS. בצנטריפוגה תאים עבור 10 דקות ב 515 XG resuspend ב 40 μL של פתרון חיץ לכל 1 x 10 7 תאים. מעבירים את ההשעיה לתא צינור 15 מ"ל ולהוסיף 10 μL של microbeads CD14 לכל 1 x 10 7 תאים, לערבב היטב דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C, והקפד לערבב את צינורות כל 5 דקות. שטפו תאים על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת חיץ לכל 1 x 10 7 תאים ו CENtrifuge ב 515 XG במשך 10 דקות. לשאוב supernatant לחלוטין מחדש להשעות עד 1 x 10 8 תאים 500 μL של פתרון חיץ. מניחים 1 טור לדגימה על מפריד מגנטי על פי הוראות היצרן. ראשית לשטוף את הטור פעם עם 500 μL של פתרון חיץ. פיפטה 500 μL של ההשעיה התא דרך הטור, מחכים בטור לייבוש ולאחר מכן לשטוף ידי חזרה שלוש פעמים זה עם פתרון חיץ. מניח צינור 15 מיליליטר חדש מתחת לעמודה ולקחת את העמודה את המפריד המגנטי. ואז לשטוף את התאים מתוך הטור לתוך צינור עם 1 מ"ל של תמיסת חיץ. להוסיף 4 מ"ל של תמיסת חיץ צנטריפוגות ב 515 XG במשך 10 דקות, ולאחר מכן מחדש להשעות ב 1 מ"ל של מכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI) בינוני. הפוך 01:10 דילולים עבור לספור על ידי הוספת 20 μL של השעיה תא 160 μL של PBS ו 20 μL של trypan כחול. ספירת התאים עםhemocytometer. התאם את ריכוז תא 6 x 10 5 / מיליליטר עם RPMI וזרעי 200 μL על צלחת הדמיה מבוססת זכוכית 35 מ"מ. דגירה לילה ב- C ° 37 עם 5% CO 2. למחרת, לפני ההדמיה, להסיר את RPMI ולהוסיף 200 μL של מדיום עצמאי 2 CO. הערה: אלה מונוציטים יכול גם להיות מובחן לתוך תת מקרופאג שונה לפני ההדמיה. אם זוהי טכניקה כדי להיחקר, נקודת התחלה מצוינת הוא הנייר האחרון על ידי Ohradanova-Repic ואח. 1 1. לאחר קצירת שכבת PBMC, להסיר את כל בסרום ורוב פתרון הבידוד הלימפוציטים, אבל להיזהר שלא להסיר את הלהקה הלבנה הקטנה על גבי הגלולה האדומה כמו זו תכיל את רוב נויטרופילים. הכינו מלאי חיץ 10x hypotonic תמס על ידי הוספת 83 גרם של NH 4 Cl ו- 10 גרם של KHCO 3 ב 1 ליטר של מים סטריליים. חנות ב 4 °ג לדלל 10x המניה הזו עם מים סטריליים ולהוסיף אותו הצינורות. ואז, להפוך בזהירות 3 פעמים לדגור קרח למשך 15 דקות. צנטריפוגה ב 394 XG במשך 10 דקות ו resuspend במאגר תמוגה hypotonic עבור 10 דקות בקרח. צנטריפוגה ב 394 XG ולשטוף פעמיים עם PBS קר. גלולה ב 1 מ"ל של מדיום עצמאי 2 CO לכל תורם. הפוך 01:10 דילולים עבור לספור על ידי הוספת 20 μL של השעיה תא 160 μL של PBS ו 20 μL של trypan כחול. ספירת התאים עם hemocytometer. עבור cytometry זרימה, ולהתאים את הריכוז כדי 6 x 10 5 / מ"ל ולהוסיף 400 ההשעיה תא μL לצלחת 24-היטב. למיקרוסקופיה, להוסיף 200 μL של אותו השעית התא בצלחת הדמיה מבוססת זכוכית 35 מ"מ. הערה: הדמיה נויטרופילים או cytometry הזרימה צריכה להיות יזם מיד בשל נטייתן לעבור אפופטוזיס אם נותר unstimulated. אם זה לא אפשרי נויטרופילים יש לשמור עלקרח בשימוש בהקדם האפשרי (בתוך אותו היום). 4. Cytometry זרימה הוספת 200 μL של 1.2 x 10 6 / מ"ל התלקחות נבגים אל התאים בצלחת 24-היטב, ולאחר מכן להוסיף 100 μL של 20 מיקרוגרם / מ"ל voriconazole. הוספת 300 μL של RPMI דגירה במשך 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. הערה: Voriconazole מתווסף למנוע נביטת נבגים. להוסיף 25 μL של פתרון המניות 1 מ"מ Calcofluor-לבן היטב כל ריכוז סופי של 25 מיקרומטר ו דגירה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. צנטריפוגה ב 582 XG במשך 10 דקות. הסר את supernatant ולשטוף פעמיים עם PBS. כדי לקצור תאים חסיד (מונוציטים), להוסיף 1 מ"ל של PBS עם 3 מ"מ EDTA לכל היטב דגירה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. לשטוף בעדינות תאים מההצלחה ידי pipetting ולאסוף תאי צינור. לשטוף פעם FACS החוצץ (נסיוב עגל עוברי 2% ל PBS), ולאחר מכן להשעות ב FACS חוצץ לניתוח FACS. לניתוח FACS, הראשון להתאים את הפרמטרים פיצוי של זרימת cytometer ולהגדיר שערים חיובי באמצעות צינורות פיצוי חד צבעוניים, כולל נבגים ללא צבע: dsRed + נבגים, AF633 + נבגים, וכן נבגים לבן + Calcofluor (כפי שנוצר ב 4.2). שער נקבע נבגים חופשיים מבוסס על קדימה ועל פיזור צד באמצעות נבגים ללא צבע. גדר תא שער על קדימה פיזור בצד ידי למעט שער הנבגים בחינם. לנתח צינור מדגם ידי הקלטת 10,000 אירועים. הערה: תאים הקשורים נבגים חיים יהיה DsRed + ו AF633 +. תאים הקשורים נבגים מתים יהיו AF633 + בלבד. תאים עוברים אורח שלא עוסקים נבגים יהיה dsRed- ו AF633-. אוכלוסיות התאים-עוסקים הנבגים מנותחים נוסף עבור מכתים Calcofluor הלבן בערוץ הכחול פסיפיק. נבגים שנותרו מחוץ לתאים יהיה + לבן Calcofluor, וכן נבגים כי כבר הפנימו יהיוCalcofluor לבן-. 5. תא חי מיקרוסקופי וידאו הערה: הבחירה של מיקרוסקופ תהיה תלויה מה זמין מקומית, אבל הגדרת מיקרוסקופ תצטרך לכלול בשלב הפוך, בתא סביבתי מחומם ל 37 מעלות צלזיוס ומסנני עירור / פליטה מתאימות dsRed (532/561 ננומטר) ו AF633 (633 ננומטר). נבגים אבוקה לא עובדים עם לייזר 488 ננומטר במקום הלייזר 532/561 ננומטר עבור dsRed. בעת ביצוע הניסוי הזה בפעם ראשונה זה, להשתמש בשלט הנבגים ללא צבע וצבע יחיד לבדוק קרינת רקע ולדמם-הדרך בין dsRed וערוצי AF633. הפעל את חימום מיקרוסקופ לפני הניסוי ולאפשר מספיק זמן עבור חדר הבקרה הסביבתי לחמם 37 ° C. הזמן שלוקח טמפרטורה בתא לייצב ישתנה להתקנות מיקרוסקופ שונות. הפעילו את מיקרוסקופ והמחשב, והנהמודעת תוכנת ההדמיה. הר צלחת הדמיה על הבמה מיקרוסקופ ולהתאים את הפוקוס כדי למצוא את הנויטרופילים או מונוציטים האדם. עבור dsRed ו AF633, להגדיר את כוח לייזר כדי 10% וחשיפה הזמן 1 s בהגדרות הרכישה. הסר את שקופית ההדמיה ולהוסיף 100 μL של 3 x 10 6 / מיליליטר התלקחות השעית נבגים אל הבארות המתאימות (נפח הכולל 300 μL / טוב). הקלט את הזמן כי התלקחות נבגים מתווספים המנה. חזרה לשקופית לשלב ולהתאים רגישות מצלמה עבור dsRed ו AF633 לראות את הנבגים בבירור אבל לא לחשוף יותר מדי את התמונה. גדר רשימת נקודות הבמה אם רכישת ריבוי נקודות נדרשה. התחל הדמיה כשכל הנקודות הן בפוקוס, הערוצים מותאמים ואת הזמן ומשך המחזור מוגדר. מחזור זמן ומשך ההדמיה תלוי בשאלות הניסיוניות. המטרה היא לשמור את זמן מחזור קצר ככל האפשר (≤2 דקות) עם 1 דק המאפשר ניתוח מעמיק של uptדינמיקת אקה.