التصوير المباشر لآخر مضاد من قبل العدلات الإنسان الأساسية وحيدات في الاستجابة لل<em> A. فوميجاتوس</em
Summary
هنا، نحن تصف بروتوكول لتقييم نشاط مضاد للخلايا المناعية الإنسان الأساسية في الوقت الحقيقي باستخدام الفلورسنت الرشاشيات مراسل غبيرات بالتزامن مع الخلية الحية المجهري الفيديو والتدفق الخلوي. توفر البيانات التي تم إنشاؤها نظرة ثاقبة المضيف الخلوي التفاعلات الرشاشيات مثل النشاط فطريات، البلعمة، والهجرة الخلية وتثبيط نمو الفطريات.
Abstract
الرشاشيات فوميجاتوس هو الممرض الفطرية الانتهازية يسبب العدوى الغازية في يستضيف المناعة مع ارتفاع معدل إماتة الحالات. وقد بحث التحقيق استجابات مناعية ضد A. فوميجاتوس محدودة بسبب عدم وجود فحوصات متسقة وموثوق بها لقياس نشاط مضاد للخلايا مناعية معينة في المختبر. ووصف طريقة جديدة لتقييم نشاط مضاد للحيدات الابتدائية والعدلات من المانحين الإنسان ضد A. فوميجاتوس باستخدام الفلورسنت الرشاشيات مراسل (FLARE) غبيرات. هذه غبيرات تحتوي على ترميز وراثيا مراسل عن dsRed، وهو ما يعبر عنه بشكل جوهري من قبل غبيرات FLARE الحية، ووصفت خارجيا مع فلور اليكسا 633، وهو مقاوم للتحلل داخل يحلول يبلوعي، مما يسمح بالتمييز بين الحية والميتة غبيرات A. فوميجاتوس. المجهر الفيديو والتدفق الخلوي تستخدم لاحقا لتصور التفاعلأيون بين غبيرات والخلايا المناعية الفطرية، تقييم النشاط فطريات بينما توفر أيضا ثروة من المعلومات حول الهجرة بلعمية، البلعمة وتثبيط نمو الفطريات. وقد وفرت هذه التقنية الجديدة بالفعل أفكارا جديدة ومثيرة في التفاعل المضيف الممرض من الخلايا المناعية الأولية ضد A. فوميجاتوس. ومن المهم أن نلاحظ الإعداد المختبرية اللازمة لأداء هذا الاختبار، بما في ذلك الفحص المجهري ضروري والتدفق الخلوي المرافق، والقدرة على العمل مع الدم المانحة البشري والفطريات التلاعب بها وراثيا. ومع ذلك، وهذا الاختبار هو قادرة على توليد كميات كبيرة من البيانات ويمكن أن تكشف عن رؤى تفصيلية في الاستجابة المضادة للفطريات. وقد تم بنجاح تستخدم هذا البروتوكول لدراسة التفاعل المضيف الممرض من الخلايا المناعية الأولية ضد A. فوميجاتوس.
ومن المهم أن نلاحظ الإعداد المختبرية اللازمة لأداء هذا الاختبار، بما في ذلك الفحص المجهري ضروري والتدفق الخلوي وacilities، والقدرة على العمل مع الدم المانحة البشري والفطريات التلاعب بها وراثيا. ومع ذلك، وهذا الاختبار هو قادرة على توليد كميات كبيرة من البيانات ويمكن أن تكشف عن رؤى تفصيلية في الاستجابة المضادة للفطريات. وقد تم بنجاح تستخدم هذا البروتوكول لدراسة التفاعل المضيف الممرض من الخلايا المناعية الأولية ضد A. فوميجاتوس.
Introduction
الرشاشيات فوميجاتوس هو الممرض الفطرية الانتهازية والسبب الفطرية الأكثر شيوعا من التهابات الرئة الغازية في مضيف المناعة 1 و 2. فهم كيف تعترف الخلايا المناعية والقضاء على الرشاشيات هو مجال هام من مجالات البحوث الفطرية، ومع ذلك، فإن فحوصات فطريات المتاحة حاليا لديهم قيود كبيرة. وتشمل الأساليب المستخدمة عادة لقياس النشاط فطريات المقايسات اللونية وتحديد مستعمرة وحدات تشكيل 3 و 4. ومع ذلك، توفر هذه الأساليب من المعلومات حول الجدوى الفطرية عند نقطة زمنية واحدة بدلا من النظر التفاعل الديناميكي بين المضيف والممرض. وبناء على ذلك، يمكن لهذه الطرق لا تأخذ في الاعتبار ما إذا كان فطر قتل أو ببساطة (مؤقتا) مقيدة في النمو أو النشاط الأيضي. لقد قمنا بتطوير طريقة قادرة على مراقبة fungiciالنشاط الدال مباشرة بينما اسر في وقت واحد معلومات مفصلة عن البلعمة، والهجرة بلعمية وتثبيط نمو الفطريات.
سابقا، تم نشر بروتوكول باستخدام التصوير في الوقت الحقيقي كوسيلة لقياس البلعمة من المبيضات البيض بواسطة خط خلية الماوس بلعم 5. وقد تم الآن تطوير هذا المفهوم أخرى لمعالجة الفجوة المعرفية في فهمنا للتفاعلات الرشاشيات مع الخلايا المناعية من خلال الاستفادة من الفلورسنت الرشاشيات مراسل (FLARE) غبيرات 6 و 7 و 8. هذه غبيرات تعبر عن fluorophore الأحمر (عن dsRed) وصفت مع fluorophore الثاني (فلور اليكسا 633). بمجرد قتل غبيرة FLARE، فإنه يتوقف عن إنتاج عن dsRed وعن dsRed المتبقية يتلاشى، في حين لا يزال AF633 الفلورسنت ومنضمة إلى غبيرات. وهذا يخلق تمييزا واضحا بين فو الحية والميتةخلايا ngal خلال تصوير الخلايا الحية والتدفق الخلوي، وتمكن تتبع مصير غبيرات الفردية التالية تفاعلها مع الخلايا المناعية.
توفر فحوصات وصف وسيلة فعالة لتصور التفاعل بين الخلايا المناعية والرشاشيات، وسوف تكون ذات قيمة كبيرة في كشف مسارات الإشارات الخلوية المسؤولة عن آليات المستجيب المضادة للفطريات في الخلايا المناعية الفطرية. وتشمل التطبيقات الأخرى تصور كيف تؤثر التغيرات في نمو الرشاشيات، مثل التحول من الراحة لغبيرات تورم، أو من غبيرات منتفخة إلى خيوط، والاعتراف بلعمية وظيفة.
يصف بروتوكول التالية بالتفصيل كيفية الحصول على حيدات الإنسان والعدلات. كيفية إعداد غبيرات FLARE. وكيفية التقاط ردودهم مع المجهر الفيديو والتدفق الخلوي. على الرغم من أن استخدام الخلايا المناعية البشرية معزولة عن التبرع بالدم هو موضح هنا، وهذاوقد أثبتت تقنية نفس القدر من الفعالية باستخدام مجموعة متنوعة من السكان الخلية الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا الأسلوب مبتكر في طريقة المختبر لدراسة نشاط مضاد للالبالعات الإنسان الأساسية ضد A. فوميجاتوس باستخدام الفلورسنت الرشاشيات مراسل (FLARE) غبيرات، تصوير الخلايا الحية والتدفق الخلوي. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن القيمة المضافة لاستخدام FLARE غبيرات سواء في الجسم الحي في عدوى فطرية التجريبية الفئران وفي تقييم المختبر من مضاد الحصانة 6 و 7. الجمع بين FLARE غبيرات مع هذا الجيل القادم الحية تقنية التصوير الخلية يسمح الإعداد لقياس جدوى غبيرات الفردي خلال التفاعلات الحيوية في المختبر.
الطريقة الموصوفة لديه القدرة على تحقيق أدوار وأهمية خاصة لبعض العمليات الخلوية للخلايا المناعية على ردودهم المضادة للفطريات. وبالإضافة إلى ذلك، والاستجابات المضادة للفطريات البالعات من المرضى الذين يعانون من معينتعرف عيوب عنصر واحد في نظام المناعة لديهم ويمكن تقييم بمزيد من التفصيل. جدا الردود المضادة للفطريات المبكرة والأولية يمكن دراستها بتفصيل كبير خلال 6 ساعات من التصوير المستمر. وهذا يسمح حتى لالفروق الدقيقة ليتم الكشف عن مثل سرعة الهجرة بلعمية نحو الفطر، ومعدلات الاستيعاب، وديناميات الأحداث فطريات 12، والتي ستكون التمييز بينهن باستخدام أساليب البلعمة التقليدية.
أي نوع من الخلايا يمكن استخدامها مع هذا الأسلوب. تم اختيار أنواع الخلايا المستخدمة هنا لأن هذه البالعات تشكل الأسطر الأولى والثانية للدفاع في الشعب الهوائية الإنسان ضد A. فوميجاتوس 13. ومن المثير للاهتمام، والاختلافات واضحة جدا ويمكن ملاحظة بين كيف حيدات والعدلات الانخراط مع الراحة وغبيرات تورم وخيوط. حيدات بالكاد الهجرة إلى غبيرات، بينما تعرض العدلات النشاط أكثر المهاجرة من ذلك بكثير. مارس الفلورسنت إضافيةاستعادة الطاقة الحركية مثل علامات حية القتلى على الخلايا المناعية يمكن أن تدرج في مقايسة لتوفير نظرة ثاقبة بقاء بلعمية التالية التفاعل مع الرشاشيات. وتشمل مثيرة للاهتمام التطبيقات المحتملة لهذه التكنولوجيا مستقبل الثقافة المشتركة لمختلف أنواع الخلايا المضيفة، والعواقب التي تترتب على الاستجابات المضادة للفطريات (على سبيل المثال، الضامة على أحادي الطبقة الظهارية، الوحيدات المستمدة الخلايا الجذعية جنبا إلى جنب مع العدلات)، وقياس الوقت الحقيقي من رد الفعل إنتاج أنواع الاكسجين أو العدلة خارج الخلية تشكيل فخ التالية التحفيز مع الرشاشيات.
تحتاج إلى الإشارة إلى بعض النقاط لاستخدام هذا البروتوكول، قبل كل شيء إعداد مختبر المطلوبة: المجهر مع مرحلة مقلوب، الغرفة البيئية مستقرة عند 37 درجة مئوية، والإثارة / مرشحات الانبعاثات لعن dsRed (532/561 نانومتر) وAF633 ( 633 نانومتر). قدرة المجهر للحفاظ على الخلايا في التركيز والاحتفاظ الغمر النفط (ذات أهمية خاصة خلال مأولتي نقطة اكتساب) يجب مراقبة بشكل دوري نظرا لطول مدة التصوير. لتقدير حجم النشاط فطريات التدفق الخلوي مطلوبة المرافق. بالإضافة إلى ذلك، تحتاج الموافقات المؤسسية والأخلاقية المناسبة لتكون في مكان العمل مع الجهات المانحة الصحي والمريض المستمدة عينات الدم والفطريات التلاعب بها وراثيا. فمن المستحسن استخدام عينات من الدم الطازج (استخدام في نفس اليوم) لزيادة قابلية الخلية والحفاظ على وظيفة. من الناحية المثالية، يتم تنفيذ عزل الخلايا مباشرة بعد وضع عينات الدم ويتم تصوير العدلات مباشرة بعد العزلة.
وفي الختام، جيل القادم الخلية الحية تقنية التصوير لتقييم في عظيم نشاط مضاد التفاصيل بلعمية ضد يوصف A. فوميجاتوس. هذه التكنولوجيا يمكن أن توفر نظرة فريدة في تفاعلات الخلايا الفطرية الفردية في أوائل الدفاعات المناعية الفطرية ضد الرشاشيات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل MRC وجامعة أبردين (مركز MRC للعلم الفطريات الطبية) وجائزة الاستراتيجية يلكوم ترست – الطبية الفطريات الفطرية المناعة (SFB، جمب، JK، AW). شكر خاص وتعطى لك الدعم من صندوق كلو. ويدعم TMH من خلال منحة من المعهد الوطني للصحة (NIH، رمز RO1 093808) ومركز ميموريال سلون كيترينج للسرطان بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح P30 CA008748. بالإضافة إلى ذلك، TMH هو محقق في التسبب في الأمراض المعدية التي يدعمها صندوق ويلكوم بوروز. ونود أن نشكر المجهر أبردين ومرفق الأنسجة لما قدموه من مساعدة والدعم.
Materials
| Glycerol | Sigma | G6279 | http://www.sigmaaldrich.com |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658 175 | http://www.greinerbioone.com/ |
| PBS | Gibco | 20012-019 | https://www.thermofisher.com/ |
| Tween-80 | Fisher Scientific | 10592955 | https://nl.fishersci.com/ |
| 40 µm filter | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | https://www.thermofisher.com/ |
| 15 ml Falcon tube | Greiner Bio-One | 188 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| 50 ml Falcon tube | Greiner Bio-One | 227 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| MilliQ | Millipore | QGARD00R1 | Nanopure water works similarly. http://www.merckmillipore.com/ |
| Biotin | Molecular Probes | B-6352 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| DMSO | Sigma | D5879 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Streptavidin-AF633 | Molecular Probes | S-21375 | AF633 is the only tested fluorophore so far that remains visible in phagosomes. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| EDTA blood tubes | Greiner Bio-One | 455036 | Any blood tubes with an anti-coagulating agent should work. http://www.greinerbioone.com/en/start/ |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | http://www3.gehealthcare.com/ |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | SV3008401 | https://www.thermofisher.com/ |
| HBSS | Gibco | 14170112 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CD14 microbeads | Myltenyi Biotec | 130-050-201 | Other monocyte isolation methods can be used as well, we prefer this method as it gives a consistent high purity of monocytes without being labor intensive. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| MS Columns | Myltenyi Biotec | 130-042-201 | See comment at CD14 microbeads. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| RPMI + Glutamax | Gibco | 72400-021 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CO2 independent medium | Thermo Fisher Scientific | 18045054 | Necessary if there is not sufficient CO2 exchange during imaging. https://www.thermofisher.com/uk/en/home |
| µ-slide 8 well glass bottom | Ibidi | 80827 | This is the imaging dish that we use, however any glass imaging dish of proper size should work. http://ibidi.com/ |
| UltraVIEW VoX 3D Live Cell Imaging System | Perkin Elmer | L7267000 | Includes volocity software for acquisition and analysis. http://www.perkinelmer.com/ |
| Calcofluor white | Sigma | 18909 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Voriconazole | Sigma | PZ0005 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| BD LSRII | BD Biosciences | Flowcytometer used. https://www.bdbiosciences.com/ |
References
- Kosmidis, C., Denning, D. W. The clinical spectrum of pulmonary aspergillosis. Thorax. 70 (3), 270-277 (2015).
- Warris, A. The biology of pulmonary Aspergillus infections. J Infect. 69 (Suppl 1), S36-S41 (2014).
- Henriet, S. S., et al. Human leukocytes kill Aspergillus nidulans by reactive oxygen species-independent mechanisms. Infect Immun. 79 (2), 767-773 (2010).
- Sheppard, D. C., et al. Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis. Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. J Vis Exp. (71), e50196 (2013).
- Heung, L. J., Jhingran, A., Hohl, T. M. Deploying FLAREs to Visualize Functional Outcomes of Host-Pathogen Encounters. PLoS Pathog. 11 (7), e1004912 (2015).
- Jhingran, A., et al. Tracing conidial fate and measuring host cell antifungal activity using a reporter of microbial viability in the lung. Cell Rep. 2 (6), 1762-1773 (2012).
- Espinosa, V., et al. Inflammatory monocytes orchestrate innate antifungal immunity in the lung. PLoS Pathog. 10 (2), e1003940 (2014).
- English, D., Andersen, B. R. Single step separation of red blood cells, granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradient of ficoll hypaque. J Immunol Met. 5 (3), 249-252 (1974).
- Shimizu, K., Keller, N. P. Genetic involvement of a cAMP-dependent protein kinase in a G protein signaling pathway regulating morphological and chemical transitions in Aspergillus nidulans. Genetics. 157 (2), 591-600 (2001).
- Ohradanova-Repic, A., Machacek, C., Fischer, M. B., Stockinger, H. Differentiation of human monocytes and derived subsets of macrophages and dendritic cells by the HLDA10 monoclonal antibody panel. Clin Transl Immunology. 5 (1), e55 (2016).
- Lewis, L. E., et al. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69 (3), 617-631 (1982).
