Inducible T7 RNA polimerasa mediada Multigene Expression System, pMGX

La co-expresión de múltiples proteínas es cada vez más esencial, particularmente en las aplicaciones de biología sintética, donde se deben expresar múltiples módulos funcionales ¹ ; En el estudio de complejos proteína-proteína, donde la expresión y la función a menudo requieren co-expresión ^{2 , 3} ; Y en la caracterización y el aprovechamiento de las vías biosintéticas, en las que cada gen en la vía debe expresarse ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8} . Se han desarrollado varios sistemas para la co-expresión, particularmente en el organismo huésped Escherichia coli , el caballo de trabajo para la expresión de proteínas recombinantes en laboratorio ⁹ . Por ejemplo, se pueden usar múltiples plásmidos con diferentes marcadores seleccionables para expresar proteínas individuales utilizando una gran cantidad de diferentes ex Vectores de presión ^{10 , 11} . Los sistemas individuales de plásmido para la expresión de múltiples proteínas han utilizado múltiples promotores para controlar la expresión de cada gen ^{10 , 12} ; Operones sintéticos, donde múltiples genes se codifican en un solo transcrito ^{2 , 13} ; O, en algunos casos, un solo gen que codifica un polipéptido que se procesa en última instancia proteolíticamente, produciendo las proteínas deseadas de interés ¹⁴ .

Figura 1: Flujo de trabajo pMGX mostrando la construcción de un vector policistrónico. El sistema pMGX proporciona una estrategia flexible y fácil de usar para la construcción de operones sintéticos bajo el control de un promotor T7 inducible.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En este manuscrito, se describe el uso de un sistema altamente eficaz para la construcción de operones sintéticos multigénicos bajo el control de una ARN polimerasa T7 inducible ( Figura 1 ). Este sistema permite que muchos genes se expresen simultáneamente a partir de un plásmido. Se basa en un sistema de plásmidos, originalmente llamado pKH22, que se ha utilizado con éxito para un número de diferentes aplicaciones ^{6 , 7 , 8} . En este caso, este conjunto de plásmidos se amplía para incluir cuatro vectores relacionados: pMGX-A, un vector de expresión que carece de etiquetas C o N-terminales y con el marcador de resistencia a la ampicilina; PMGX-hisA, un vector de expresión que codifica una etiqueta de hexahistidina N-terminal y con el marcador de resistencia a la ampicilina; PMGX-K, un vector de expresión lMarcar cualquier marcador C o N-terminal y con el marcador de resistencia a la kanamicina; Y pMGX-hisK, un vector de expresión que codifica una etiqueta de hexahistidina N-terminal y con el marcador de resistencia a la kanamicina. En este estudio, se demuestra el método para generar un vector policistrónico que contiene cinco genes usando el sistema pMGX, específicamente pMGX-A, junto con la producción exitosa de cada proteína individual en Escherichia coli .