Inducibile T7 RNA Polymerase-mediato sistema di espressione multigene, pMGX

La coespressione di molteplici proteine ​​è sempre più essenziale, in particolare nelle applicazioni di biologia sintetica, in cui devono essere espressi più moduli funzionali ¹ ; Nello studio dei complessi proteico-proteici, in cui espressione e funzione richiedono spesso co-espressione ^{2 , 3} ; E nel caratterizzare e sfruttare percorsi biosintetici, in cui ogni gene nel percorso deve essere espresso ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8} . Sono stati sviluppati diversi sistemi per la coespressione, in particolare nell'organismo ospitante Escherichia coli , il cavallo da lavoro per l'espressione di proteine ​​ricombinanti di laboratorio ⁹ . Ad esempio, plasmidi multipli con differenti marcatori selectable possono essere utilizzati per esprimere singole proteine ​​usando una ricchezza di diversi es Vettori di pressione ^{10 , 11} . I singoli sistemi plasmidi per l'espressione multipla di proteine ​​hanno utilizzato sia promotori multipli per controllare l'espressione di ciascun gene ^{10 , 12} ; Operoni sintetici, in cui i geni multipli sono codificati su una singola trascrizione ^{2 , 13} ; O, in alcuni casi, un singolo gene che codifica un polipeptide che viene ultimamente elaborato in modo proteolitico, fornendo le proteine ​​desiderate di interesse ¹⁴ .

Figura 1: flusso di lavoro pMGX che mostra la costruzione di un vettore policistronico. Il sistema pMGX fornisce una strategia flessibile e facile da usare per la costruzione di operoni sintetici sotto il controllo di un promotore T7 induttivo.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In questo manoscritto è descritto l'uso di un sistema altamente efficace per la costruzione di operoni sintetici multigene sotto il controllo di una polimerasi RNA T7 indottabile ( figura 1 ). Questo sistema permette che molti geni siano espressi simultaneamente da un plasmide. È basato su un sistema plasmidico, originariamente chiamato pKH22, che è stato utilizzato con successo per una serie di applicazioni diverse ^{6 , 7 , 8} . Qui, questo set di plasmidi viene ampliato per includere quattro vettori correlati: pMGX-A, un vettore di espressione privo di qualsiasi etichetta C- o N-terminale e con il marker di resistenza dell'ampicillina; PMGX-hisA, un vettore di espressione che codifica un tag di esahistidina N-terminale e con il marker di resistenza dell'ampicillina; PMGX-K, un vettore di espressione lAcking qualsiasi etichetta C- o N-terminale e con il marker di resistenza alla kanamycina; E pMGX-hisK, un vettore di espressione che codifica un tag di hexahistidine N-terminale e con il marker di resistenza alla kanamycina. In questo studio è stato dimostrato il metodo per la generazione di un vettore polistronicico contenente cinque geni usando il sistema pMGX, in particolare pMGX-A, insieme alla produzione di ogni singola proteina in Escherichia coli .