В этом исследовании описаны способы опосредованной T7 совместной экспрессии нескольких генов из одной плазмиды в Escherichia coli с использованием плазмидной системы pMGX.
Совместная экспрессия нескольких белков приобретает все большее значение для синтетической биологии, изучает белково-белковые комплексы и характеризует и использует пути биосинтеза. В этой рукописи описывается использование высокоэффективной системы для построения мультигенных синтетических оперонов под контролем индуцируемой РНК-полимеразы Т7. Эта система позволяет одновременно размножать гены из одной плазмиды. Здесь набор из четырех связанных векторов, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K и pMGX-hisK, с маркером (A и K), устойчивым к ампициллину или канамицину, и либо обладающим, либо отсутствующим N-концевым гексагистидином Тег (его). Подробные протоколы для построения синтетических оперонов с использованием этой векторной системы предоставляются вместе с соответствующими данными, показывая, что система на основе pMGX, содержащая пять генов, может быть легко сконструирована и использована для получения всех пяти кодированных белков в Escherichia coli . Эта системаEm и протокол позволяют исследователям регулярно выражать сложные многокомпонентные модули и пути в E. coli .
Совместная экспрессия нескольких белков становится все более существенной, особенно в приложениях для синтетической биологии, где должны быть выражены несколько функциональных модулей 1 ; При изучении белково-белковых комплексов, где экспрессия и функция часто требуют совместного экспрессии 2 , 3 ; И в характеристике и использовании путей биосинтеза, где каждый ген в пути должен быть выражен 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Был разработан ряд систем для совместной экспрессии, особенно в организме хозяина Escherichia coli , рабочей лошади для экспрессии лабораторного рекомбинантного белка 9 . Например, несколько плазмид с различными выбираемыми маркерами могут быть использованы для экспрессии отдельных белков с использованием богатства различных экс Векторы растяжения 10 , 11 . Одиночные плазмидные системы для множественной экспрессии белка использовали либо множественные промоторы для контроля экспрессии каждого гена 10 , 12 ; Синтетические опероны, где множественные гены кодируются на одном транскрипте 2 , 13 ; Или, в некоторых случаях, один ген, кодирующий полипептид, который в конечном счете протеолитически обработан, давая желаемые представляющие интерес белки 14 .
Рисунок 1: рабочий процесс pMGX, показывающий построение полицистронного вектора. Система pMGX обеспечивает гибкую и легкую в использовании стратегию для создания синтетических оперонов под контролем индуцибельного промотора T7.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
В этой рукописи описывается использование высокоэффективной системы для построения мультигенных синтетических оперонов под контролем индуцируемой РНК-полимеразы Т7 ( фиг. 1 ). Эта система позволяет одновременно размножать гены из одной плазмиды. Он основан на плазмидной системе, первоначально называемой pKH22, которая была успешно использована для ряда различных приложений 6 , 7 , 8 . Здесь этот набор плазмид расширяется до четырех связанных векторов: pMGX-A, экспрессирующего вектора, лишенного любых C- или N-концевых тегов, и маркера устойчивости к ампициллину; PMGX-hisA, вектор экспрессии, кодирующий N-концевую гексагистидиновую метку и маркер устойчивости к ампициллину; PMGX-K, вектор экспрессии lПодбирая любые C- или N-концевые метки и маркер устойчивости к канамицину; И pMGX-hisK, вектор экспрессии, кодирующий N-концевую гексагистидиновую метку и маркер устойчивости к канамицину. В этом исследовании продемонстрирован способ генерации полицистронного вектора, содержащего пять генов с использованием системы pMGX, в частности pMGX-A, наряду с успешным продуцированием каждого отдельного белка в Escherichia coli .
Совместная экспрессия множественных генов приобретает все большее значение, особенно при характеристике и восстановлении сложных многогенных метаболических путей 3 , 4 , 5 . Система pMGX делает мультигенную совместную экспрессию в рутин…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады.
Enzymes | |||
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England Biolabs | M0290S | |
AvrII | New England Biolabs | R0174S | |
EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
XbaI | New England Biolabs | R0145S | |
Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600677 | |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
1 kb DNA ladder | New England Biolabs | N3232L | |
4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels | Bio-Rad | 456-8095 | |
50 x TAE | Fisher Thermo Scientific | BP1332-4 | |
Agar | Fisher Thermo Scientific | BP1423-500 | |
Agarose | Fisher Thermo Scientific | BP160-500 | |
Ampicilin | Sigma-Alrich | A9518-5G | |
BL21 (DE3) chemically comeptent cells | Comeptent cell prepared in house | ||
B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent | Fisher Thermo Scientific | PI78243 | |
dNTP mix | Agilent Technologies | Supplied with polymerase | |
Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972 |
Glycine | Fisher Thermo Scientific | BP381-1 | |
His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse | GenScript | A00612 | |
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | EMD Millipore | WBKLS0100 | |
IPTG | Sigma-Alrich | 15502-10G | |
LB | Fisher Thermo Scientific | BP1426-500 | |
Methanol | Fisher Thermo Scientific | A411-20 | |
Pasteurized instant skim milk powder | Local grocery store | No-name grocery store milk is adequate | |
Nitrocellulose membrane | Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) | 10600007 | Membrane PT 0.45 µm 200 mm X 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086 |
Plasmid DNA Isolation Kit | Omega | D6943-02 | E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898 |
pMGX | Boddy Lab | Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca | |
Primers | Intergrated DNA Technologies | Design primers as needed for desired gene | |
Synthetic Gene | Life Technologies | Design and optimize as needed | |
Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703932 | |
Tris base | BioShop | TRS001.1 | |
Tween-20 | Sigma-Alrich | P9416-50ML | |
XL1-Blue chemically competent cells | Comeptent cell prepared in house | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
BioSpectrometer | Eppendorf | RK-83600-07 | |
Gel box – PAGE | Bio-Rad | 1658005 | Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell |
Gel Imager | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
Incubator-oven | Fisher Thermo Scientific | 11-690-650D | Isotemp |
Incubator-shaker | Fisher Thermo Scientific | SHKE6000-7 | MaxQ 6000 |
Personna Razors | Fisher Thermo Scientific | S04615 | |
Power Pack | Bio-Rad | S65533Q | FB300 |
Transilluminator | VWR International | M-10E,6W | |
Thermocylcer | Eppendorf | Z316091 | Mastercycler Personal, supplied by Sigma |
UV Face-Shield | 18-999-4542 | ||
Waterbath | Fisher Thermo Scientific | 15-460-2SQ | |
Western Transfer Apparatus | Bio-Rad | 1703935 | Mini-Trans Blot Cell |