Sistema Induzível de Expressão Multigênica mediada por polimerização T7 de T7, pMGX

A co-expressão de múltiplas proteínas é cada vez mais essencial, particularmente em aplicações de biologia sintética, onde vários módulos funcionais devem ser expressos ¹ ; No estudo dos complexos proteína-proteína, onde a expressão e função muitas vezes requerem co-expressão ^{2 , 3} ; E na caracterização e aproveitamento de caminhos biossintéticos, onde cada gene na via deve ser expresso ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8} . Vários sistemas foram desenvolvidos para coexpressão, particularmente no organismo hospedeiro Escherichia coli , o cavalo de trabalho para a expressão de proteína recombinante em laboratório ⁹ . Por exemplo, múltiplos plasmídeos com diferentes marcadores selecionáveis ​​podem ser usados ​​para expressar proteínas individuais usando uma riqueza de diferentes ex Vetores de pressão ^{10 , 11} . Os sistemas plasmídicos únicos para expressão múltipla de proteínas utilizaram múltiplos promotores para controlar a expressão de cada gene ^{10 , 12} ; Operões sintéticos, onde múltiplos genes são codificados em uma única transcrição ^{2 , 13} ; Ou, em alguns casos, um único gene que codifica um polipéptido que é processado de forma proteolítica, produzindo as proteínas desejadas de interesse ¹⁴ .

Figura 1: fluxo de trabalho pMGX que mostra a construção de um vetor policristão. O sistema pMGX fornece uma estratégia flexível e fácil de usar para a construção de operões sintéticos sob o controle de um promotor T7 indutível.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Neste manuscrito, é descrito o uso de um sistema altamente eficaz para a construção de operões sintéticos multigene sob o controle de uma ARN polimerase T7 indutível ( Figura 1 ). Este sistema permite que muitos genes sejam expressos simultaneamente a partir de um plasmídeo. É baseado em um sistema de plasmídeo, originalmente chamado pKH22, que foi utilizado com sucesso para várias aplicações diferentes ^{6 , 7 , 8} . Aqui, este conjunto de plasmídeo é expandido para incluir quatro vetores relacionados: pMGX-A, um vetor de expressão que não possui quaisquer marcas C ou N-terminal e com o marcador de resistência à ampicilina; PMGX-hisA, um vetor de expressão que codifica uma etiqueta de hexahistidina N-terminal e com o marcador de resistência à ampicilina; PMGX-K, um vetor de expressão lObtendo quaisquer tags C ou N-terminal e com o marcador de resistência à kanamicina; E pMGX-hisK, um vetor de expressão que codifica uma etiqueta de hexahistidina N-terminal e com o marcador de resistência à canamicina. Neste estudo, o método para a geração de um vetor policristão contendo cinco genes usando o sistema pMGX, especificamente pMGX-A, é demonstrado juntamente com a produção bem-sucedida de cada proteína individual em Escherichia coli .