Système d'expression multigène médié par l'ARN T7 à ADN polymère induible, pMGX

La co-expression de multiples protéines est de plus en plus essentielle, en particulier dans les applications de biologie synthétique, où plusieurs modules fonctionnels doivent être exprimés ¹ ; Dans l'étude des complexes protéine-protéine, où l'expression et la fonction nécessitent souvent une co-expression ^{2 , 3} ; Et dans la caractérisation et l'exploitation des voies de biosynthèse, où chaque gène dans la voie doit être exprimé ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8} . Un certain nombre de systèmes ont été développés pour la co-expression, en particulier dans l'organisme hôte Escherichia coli , le cheval de travail pour l'expression de protéines recombinantes en laboratoire ⁹ . Par exemple, de multiples plasmides avec différents marqueurs sélectionnables peuvent être utilisés pour exprimer des protéines individuelles en utilisant une multitude d'ex différents Vecteurs de pression ^{10 , 11} . Des systèmes plasmidiques simples pour une expression de protéines multiples ont utilisé soit des promoteurs multiples pour contrôler l'expression de chaque gène ^{10 , 12} ; Opérons synthétiques, où plusieurs gènes sont codés sur une seule transcription ^{2 , 13} ; Ou, dans certains cas, un seul gène codant pour un polypeptide qui est finalement transformé de façon protéolytique, donnant les protéines désirées d'intérêt ¹⁴ .

Figure 1: flux de travail pMGX montrant la construction d'un vecteur polycistronique. Le système pMGX offre une stratégie flexible et facile à utiliser pour la construction d'opérons synthétiques sous le contrôle d'un promoteur T7 inducible.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Dans ce manuscrit, on décrit l'utilisation d'un système très efficace pour la construction d'opérons synthétiques multigène sous le contrôle d'une ARN polymérase T7 induite ( figure 1 ). Ce système permet d'exprimer plusieurs gènes simultanément à partir d'un plasmide. Il est basé sur un système plasmide, initialement appelé pKH22, qui a été utilisé avec succès pour un certain nombre d'applications différentes ^{6 , 7 , 8} . Ici, ce jeu de plasmide est développé pour inclure quatre vecteurs apparentés: pMGX-A, un vecteur d'expression dépourvu de marqueurs C ou N-terminaux et avec le marqueur de résistance à l'ampicilline; PMGX-hisA, un vecteur d'expression codant une étiquette d'hexahistidine N-terminal et avec le marqueur de résistance à l'ampicilline; PMGX-K, un vecteur d'expression lAvoir des marqueurs C ou N-terminaux et avec le marqueur de résistance à la kanamycine; Et pMGX-hisK, un vecteur d'expression codant une étiquette d'hexahistidine N-terminal et avec le marqueur de résistance à la kanamycine. Dans cette étude, le procédé de génération d'un vecteur polycistronique contenant cinq gènes utilisant le système pMGX, en particulier pMGX-A, est démontré avec la production réussie de chaque protéine individuelle dans Escherichia coli .