Summary

Induzierbares T7-RNA-Polymerase-vermitteltes Multigen-Expressionssystem, pMGX

Published: June 27, 2017
doi:

Summary

Diese Studie beschreibt Methoden für die T7-vermittelte Co-Expression von mehreren Genen aus einem einzigen Plasmid in Escherichia coli unter Verwendung des pMGX-Plasmidsystems.

Abstract

Die Co-Expression mehrerer Proteine ​​ist für die synthetische Biologie immer wichtiger, studiert Protein-Protein-Komplexe und charakterisiert und nutzt Biosynthesewege. In diesem Manuskript wird die Verwendung eines hochwirksamen Systems für die Konstruktion von multigenen synthetischen Operons unter der Kontrolle einer induzierbaren T7-RNA-Polymerase beschrieben. Dieses System erlaubt es, dass viele Gene gleichzeitig aus einem Plasmid exprimiert werden. Hier ist ein Satz von vier verwandten Vektoren, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K und pMGX-hisK, entweder mit dem Ampicillin- oder Kanamycin-resistente Marker (A und K) und entweder mit einem N-terminalen Hexahistidin oder einem N-terminalen Hexahistidin Tag (seine) werden offenbart. Detaillierte Protokolle für die Konstruktion von synthetischen Operen, die dieses Vektorsystem verwenden, werden zusammen mit den entsprechenden Daten bereitgestellt, was zeigt, dass ein pMGX-basiertes System, das fünf Gene enthält, leicht konstruiert und verwendet werden kann, um alle fünf codierten Proteine ​​in Escherichia coli zu produzieren . Dieses systEm und Protokoll ermöglicht es Forschern, routinemäßig komplexe Mehrkomponentenmodule und Wege in E. coli auszudrücken.

Introduction

Die Koexpression mehrerer Proteine ​​ist zunehmend von wesentlicher Bedeutung, vor allem in synthetischen Biologieanwendungen, bei denen mehrere Funktionsmodule ausgedrückt werden müssen 1 ; Bei der Untersuchung von Protein-Protein-Komplexen, wo Expression und Funktion oft Co-Expression 2 , 3 erfordern; Und bei der Charakterisierung und Nutzung von Biosynthesewegen, wo jedes Gen im Weg ausgedrückt werden muss 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Eine Reihe von Systemen wurde für die Co-Expression entwickelt, insbesondere im Wirtsorganismus Escherichia coli , dem Arbeitspferd für die rekombinante Protein-Expression des Labors 9 . Zum Beispiel können mehrere Plasmide mit unterschiedlichen selektierbaren Markern verwendet werden, um einzelne Proteine ​​unter Verwendung einer Fülle von verschiedenen ex zu exprimieren Druckvektoren 10 , 11 . Einzelne Plasmidsysteme für die multiple Proteinexpression haben entweder mehrere Promotoren verwendet, um die Expression jedes Gens 10 , 12 zu kontrollieren; Synthetische Operons, wo mehrere Gene auf einem einzigen Transkript 2 , 13 codiert sind; Oder in einigen Fällen ein einzelnes Gen, das für ein Polypeptid kodiert, das letztlich proteolytisch verarbeitet wird, wobei die gewünschten interessierenden Proteine 14 erhalten werden .

Abbildung 1
Abbildung 1: pMGX-Workflow, der den Aufbau eines polycistronischen Vektors zeigt. Das pMGX-System bietet eine flexible, einfach zu bedienende Strategie für den Bau von synthetischen Operons unter der Kontrolle eines induzierbaren T7-Promotors.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

In diesem Manuskript wird die Verwendung eines hochwirksamen Systems für die Konstruktion von multigenen synthetischen Operons unter der Kontrolle einer induzierbaren T7-RNA-Polymerase ( Fig. 1 ) beschrieben. Dieses System erlaubt es, dass viele Gene gleichzeitig aus einem Plasmid exprimiert werden. Es basiert auf einem Plasmidsystem, das ursprünglich pKH22 genannt wurde und das für eine Reihe von verschiedenen Anwendungen 6 , 7 , 8 erfolgreich eingesetzt wurde . Hier wird dieser Plasmidsatz um vier verwandte Vektoren erweitert: pMGX-A, ein Expressionsvektor ohne C- oder N-terminale Markierungen und mit dem Ampicillin-Resistenzmarker; PMGX-hisA, ein Expressionsvektor, der für ein N-terminales Hexahistidin-Tag und mit dem Ampicillin-Resistenzmarker kodiert; PMGX-K, ein Expressionsvektor lAcking alle C- oder N-terminalen Markierungen und mit dem Kanamycin-Resistenz-Marker; Und pMGX-hisK, ein Expressionsvektor, der für ein N-terminales Hexahistidin-Tag und mit dem Kanamycin-Resistenzmarker kodiert. In dieser Studie wird das Verfahren zur Erzeugung eines polycistronischen Vektors, der fünf Gene enthält, unter Verwendung des pMGX-Systems, insbesondere pMGX-A, zusammen mit der erfolgreichen Produktion jedes einzelnen Proteins in Escherichia coli gezeigt .

Protocol

1. Erhalten von Genen von Interesse Design synthetische Gene. Optimieren Sie eine Gensequenz für die E. coli- Expression. Entfernen Sie alle problematischen Restriktionsstellen aus der Sequenz (AvrII, NdeI, EcoRI und XbaI). Einbindung von Restriktionsstellen für das Klonen; Eine 5'-NdeI-Stelle und eine 3'-EcoRI-Stelle werden empfohlen. Andere Standorte können bei Bedarf verwendet werden; Beziehen sich auf den Multicloning-Bereich des ausgewähl…

Representative Results

In dieser Studie war es das Ziel, fünf Proteine ​​aus einem einzigen Plasmid zu exprimieren. Die Fünf-Codon-optimierten synthetischen Genfragmente, die entweder N- oder C-terminale Hexahistidin-Markierungen codieren, wurden kommerziell gekauft. Die synthetischen Gene wurden durch PCR amplifiziert und einzeln in einen PCR-stumpfen Vektor kloniert und sequenziert. Um das polycistronische Plasmid zu erzeugen, wurden die fünf interessierenden Gene zuerst in ein geeignetes pMGX-Plasmid…

Discussion

Die Koexpression mehrerer Gene ist immer wichtiger, insbesondere bei der Charakterisierung und Rekonstitution komplexer, multigener Stoffwechselwege 3 , 4 , 5 . Das pMGX-System macht die Multigene-Koexpression in der E. coli- Routine 6 , 7 , 8 und ist für verschiedene Forscher zugänglich. In dieser Studie wurden fünf Protei…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom Naturwissenschaften und Ingenieurforschungsrat von Kanada unterstützt.

Materials

Enzymes
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) New England Biolabs M0290S
AvrII New England Biolabs R0174S
EcoRI New England Biolabs R0101S
NdeI New England Biolabs R0111S
XbaI New England Biolabs R0145S
Herculase II Fusion DNA Polymerase Agilent Technologies 600677
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
1 kb DNA ladder New England Biolabs N3232L
4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels Bio-Rad 456-8095
50 x TAE Fisher Thermo Scientific BP1332-4
Agar Fisher Thermo Scientific BP1423-500
Agarose Fisher Thermo Scientific BP160-500
Ampicilin Sigma-Alrich A9518-5G
BL21 (DE3) chemically comeptent cells Comeptent cell prepared in house
B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent Fisher Thermo Scientific PI78243
dNTP mix Agilent Technologies Supplied with polymerase
Gel Extraction Kit Omega D2500-02 E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972
Glycine Fisher Thermo Scientific BP381-1
His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse GenScript A00612
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate EMD Millipore WBKLS0100
IPTG Sigma-Alrich 15502-10G
LB Fisher Thermo Scientific BP1426-500
Methanol Fisher Thermo Scientific A411-20
Pasteurized instant skim milk powder Local grocery store No-name grocery store milk is adequate
Nitrocellulose membrane Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) 10600007 Membrane PT 0.45 µm 200 mm X 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086
Plasmid DNA Isolation Kit Omega D6943-02 E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898
pMGX Boddy Lab Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca
Primers Intergrated DNA Technologies Design primers as needed for desired gene
Synthetic Gene Life Technologies Design and optimize as needed
Thick Blot Filter Paper Bio-Rad 1703932
Tris base BioShop TRS001.1
Tween-20 Sigma-Alrich P9416-50ML
XL1-Blue chemically competent cells Comeptent cell prepared in house
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
BioSpectrometer Eppendorf RK-83600-07
Gel box – PAGE Bio-Rad 1658005 Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell
Gel Imager Alpha Innotech AlphaImager EC
Incubator-oven Fisher Thermo Scientific 11-690-650D Isotemp
Incubator-shaker Fisher Thermo Scientific SHKE6000-7 MaxQ 6000
Personna Razors Fisher Thermo Scientific S04615
Power Pack Bio-Rad S65533Q FB300
Transilluminator VWR International M-10E,6W
Thermocylcer Eppendorf Z316091 Mastercycler Personal, supplied by Sigma
UV Face-Shield 18-999-4542
Waterbath Fisher Thermo Scientific 15-460-2SQ
Western Transfer Apparatus Bio-Rad 1703935 Mini-Trans Blot Cell

References

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Cite This Article
Hassan, M. I., McSorley, F. R., Hotta, K., Boddy, C. N. Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX. J. Vis. Exp. (124), e55187, doi:10.3791/55187 (2017).

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