Experimentelles Protokoll zum Nachweis<em> Cyanobakterien</em> In flüssigen und festen Proben mit einem Antikörper Microarray-Chip

Der Nachweis und die Überwachung von Mikroorganismen in komplexen natürlichen mikrobiellen Gemeinschaften sind von entscheidender Bedeutung in vielen Bereichen, einschließlich der Biomedizin, die Umweltökologie und Astrobiologie. Cyanobakterien sind prokaryotische Mikroorganismen bekannt für ihre Fähigkeit , Blüten (übermäßige Proliferation) von Zellen in frischem Wasser zu bilden. Sie sind allgegenwärtig, und viele Arten sind in der Lage, Giftstoffe zu produzieren, was sich nicht nur auf ein potenzielles Risiko für die menschliche Gesundheit, sondern auch zu einer ökologischen Auswirkungen. In dieser Hinsicht ist es wichtig , eine schnelle und empfindliche Verfahren zur Früherkennung von Cyanobakterien und / oder deren Toxine in Boden und Wasser zu entwickeln. Zu diesem Zweck wird ein Multiplex-Fluoreszenz-Sandwich-Microarray-Immunoassay (FSMI) wurde als ein Werkzeug entwickelt für die Wasser Manager ihnen bei der Entscheidungsfindung zu helfen und damit in Programme richtige Wassermanagement.

Ein breites Spektrum von Methoden entwickelt worden, Cyan zu erkennen und zu identifizierenobacterial Zellen und Cyanotoxine in Boden und Wasser, einschließlich der optischen Mikroskopie, Molekularbiologie und immunologischen Techniken. Diese Verfahren können sehr unterschiedlich in den Informationen, die sie liefern. Mikroskopische Techniken basieren auf Zellmorphologie und den Nachweis von in vivo – Fluoreszenz von cyanobakteriellen Pigmente, wie Phycocyanin oder ¹ Chlorophyll. Obwohl sie schnell und billig Methoden für die Echtzeit und häufige Überwachung sind , die über die Art und Anzahl der Cyanobakterien in einer Probe vorhanden informieren, geben sie keine Informationen über die mögliche Toxizität. Außerdem erfordern sie ein gewisses Maß an Know – how, wenn man bedenkt , daß es oft sehr schwierig ist , ^zwei zwischen eng verwandten Arten zu unterscheiden. Um diese Einschränkungen zu, Lichtmikroskopie zu überwinden muss sowohl durch die Identifizierung und Quantifizierung von Cyanotoxine biologischen und biochemischen Screening-Assays und physikalisch-chemischen Methoden begleitet werden.

<pclass = "jove_content"> Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA), Protein-phosphat Hemmtests (PPIA) und neurochemische Tests in Mäusen sind Beispiele für biochemische Screening-Assays zum Nachweis von Cyanotoxine. Während die ersten beiden schnelle und empfindliche Methoden sind, haben Fehlalarmen beschrieben worden bei Verwendung von ELISA und PPIA Tests auf drei Arten von Toxinen sind eingeschränkt. Die Maus-Bioassay ist eine qualitative Technik mit geringer Empfindlichkeit und Präzision, und spezielle Lizenzierung und Ausbildung erforderlich ist. Darüber hinaus gibt es nicht Informationen über die Art von Toxinen in einer Probe vorhanden. Cyanotoxine kann durch andere analytische Verfahren, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS), Gaschromatographie (GC), Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) identifiziert und quantifiziert werden, oder Matrix-unterstützte Laser-Desorption / Ionisations-Flugzeit (MALDI-TOF). Dies ist jedoch nur möglich, wenn Referenzstandards, die brauchen werdened einzelnen Toxinkonzentrationen in komplexen Proben zu bestimmen, sind ^{3 verfügbar, 4.} Darüber hinaus sind diese Methoden zeitaufwendig; erfordern teure Ausrüstung, Verbrauchsmaterialien und Probenvorbereitung; und muss von erfahrenen und spezialisierten Personal durchgeführt werden.

Molecular-basierte Methoden seit Jahrzehnten angewendet wurden zu erfassen, zu identifizieren und zu quantifizieren Cyanobakterien und ihre entsprechenden Cyanotoxine dank der Sequenzinformation in den Genomdatenbanken veröffentlicht (zB National Center for Biotechnology Information, NCBI). Unter diesen Verfahren sind solche auf Basis der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die den Entwurf von Sätzen von Primern für die DNA-Amplifikation erfordert und hängen von Vorwissen von DNA-Sequenzen verschiedener Spezies Cyanobakterien. Während Gendetektion, wie das phycocyanin Operon, auf der Gattungsebene, um eine genaue Identifizierung führt, sind einige Arten oder Stämme unentdeckt mitdiese Methode. Jedoch Toxin-kodierenden Gene, wie diejenigen , auf die Microcystin – Operon gehören, ermöglichen die Identifizierung von Toxinen in Proben , in denen die Hersteller sind knapp ^5. Nichtsdestoweniger ist der Nachweis von Toxin-Marker durch PCR nicht notwendigerweise Toxizität in die Umwelt bedeuten. Darüber hinaus entwickelt die Menge der Primer das gesamte Spektrum der Arten von Cyanobakterien und Toxinproduzenten in einer Probe zu analysieren ist noch unvollständig, und weitere Studien müssen zu identifizieren unbekannte Arten erfolgen. Andere molekulare Techniken sind nicht auf PCR-Basis, wie Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) und DNA – Mikroarrays.

In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich Microarray-Technologie Bedeutung in vielen Bereichen Anwendung gewonnen, vor allem in der Umweltüberwachung. DNA – Mikroarrays ermöglichen eine Unterscheidung zwischen Arten und Analyten ^{4, 6, 7} </^{sup>, 8, 9, 10,} aber sie sind sehr mühsam und zeitraubenden Aufgaben betrachtet , die mehrere Stufen (zB Microarray – Leistung, DNA – Extraktion, PCR – Amplifikation und Hybridisierung) beinhalten. Aus diesem Grund weniger zeitraubend Assays basieren auf Antikörpern, wie Sandwich- und kompetitive immunologische Mikroarrays sind ein wesentlicher und zuverlässige Hochdurchsatz – Verfahren zum Nachweis von mehreren Analyten Umwelt ^{11, 12, 13} geworden. Die Fähigkeit von Antikörpern, spezifisch ihre Zielverbindungen erkennen und geringe Mengen an Analyten und zum Nachweis von Proteinen, zusammen mit der Möglichkeit, Antikörper gegen nahezu jede Substanz, stellen Antikörper-Mikroarrays eine leistungsstarke Technik für Umweltzwecke zu erzeugen. Darüber hinaus analysiert die Fähigkeit, mehrere erreichen in alsingle Assay, mit Nachweisgrenzen von ppb bis hin zu ppm, ist einer der wichtigsten Vorteile dieses Verfahrens ^14.

Antikörper-basierte Biosensoren haben sich als empfindliche und schnelle Werkzeuge für die Detektion von einer Vielzahl von Pathogenen und Toxinen in der Umweltüberwachung zu ^{15, 16, 17, 18, 19, 20, 21.} Während DNA-Verfahren mehrere Schritte umfassen, die Antikörper-basierte Mikroarrays erfordern nur eine geringe Probenvorbereitung, die auf einem kurzen Lyseschritt in einem geeigneten Lösungspuffer hauptsächlich basiert. Delehanty und Ligler ¹⁵ berichtet , die den gleichzeitigen Nachweis von Proteinen und bakteriellen Analyten in komplexen Mischungen auf der Basis eines Antikörper – Sandwich – Immunoassay geeignet zum Nachweis einer Proteinkonzentration von 4 ppb eind 10 ⁴ cfu / ml Zellen. Szkola et al. ²¹ weisen eine günstige und zuverlässige Multiplex- Microarray zur gleichzeitigen Detektion von proteotoxins und kleine Toxine, Verbindungen entwickelt , die in der biologischen Kriegsführung verwendet werden könnten. Sie detektiert Konzentrationen von Ricintoxin, mit einer Nachweisgrenze von 3 ppb, in weniger als 20 min. Vor kurzem hat die CYANOCHIP, ein Antikörper – Microarray-basierten Biosensor für die in – situ – Detektion von toxischen und nicht toxischen Cyanobakterien, wurde ²² beschrieben. Dieses Mikroarray ermöglicht die Identifizierung von potentiellen Cyanobakterienblüten, meist in Wasserumgebungen, die mikroskopisch identifiziert schwierig sind. Die Nachweisgrenze des Mikroarrays ist ^{10. Februar – 10. MÄRZ} Zellen für die meisten Arten, dieses Biosensors in ein kostengünstiges Werkzeug für die Multiplex – Detektion und Identifizierung von Cyanobakterien drehen, auch auf Artenebene. Alle diese Eigenschaften machen den Antibody Microarray-Technik und insbesondere in dieser Arbeit vorgestellten Verfahren eine schnellere und einfachere Methode zu den oben genannten Techniken verglichen.

Diese Arbeit stellt zwei Beispiele von Experimenten , die einen Antikörper Biochip-basierten Biosensor , um die Anwesenheit von Cyanobakterien in Boden- und Wasserproben nachzuweisen. Es ist ein einfaches und zuverlässiges Verfahren auf einem Sandwich-Immunoassay-Format basiert, das Volumen und sehr einfache Probenvorbereitung sehr kleine Probe erfordert. Das Verfahren benötigt eine kurze Zeit, und kann leicht in dem Gebiet durchgeführt werden.