פרוטוקול הניסוי לזיהוי<em> כחוליות</em> בדגימות נוזלים ומוצקים עם צ'יפ Microarray נוגדן

איתור וניטור של מיקרואורגניזמים קהילות חיידקים טבע מורכבים הם קריטיים בתחומים רבים, כולל ביו-רפואה, אקולוגיה סביבתית, לאסטרוביולוגיה. כחוליות הם מיקרואורגניזמים פרוקריוטים ידועים ביכולתם ליצור פורח (התפשטות מוגזמת) של תאים במים מתוקים. הם נמצאים בכל מקום, ומינים רבים מסוגלים לייצר רעלנים, מובילה לא רק כדי סיכון פוטנציאלי לבריאות האדם, אלא גם השפעה אקולוגית. בהקשר זה, חשוב לפתח שיטות מהירות ורגישות לגילוי המוקדם של כחוליות ו / או רעלנים שלהם באדמה ובמים. לצורך זה, immunoassay microarray הכריך פלורסנט זמנית (FSMI) פותח ככלי מנהלי מים כדי לסייע להם בקבלת החלטות, וכתוצאה מכך, ביישום תוכניות ניהול מים נאותות.

מגוון רחב של שיטות פותח כדי לאתר ולזהות ציאןתאים cyanotoxins obacterial באדמה ובמים, כולל מיקרוסקופיה אופטית, ביולוגיה מולקולרית, וטכניקות אימונולוגית. שיטות אלה יכולים להשתנות במידה רבה את המידע שהם מספקים. טכניקות מיקרוסקופיות מבוססות על מורפולוגיה תאי זיהוי של קרינת in vivo מ פיגמנטים כחוליות, כגון phycocyanin או כלורופיל ^1. למרות שהם שיטות מהירות וזולות עבור בזמן אמת ניטור תכוף כי להודיע על הסוג והמספר כחוליות נוכח מדגם, הם לא נותנים מידע על הרעילות האפשרית. בנוסף, הם דורשים רמה מסוימת של מומחיות, בהתחשב בכך הוא לעתים קרובות קשה מאוד להבחין בין מינים קרובים ^2. כדי להתגבר על המגבלות האלה, מיקרוסקופ אור חייב להיות מלווה על ידי שני מבחני המיון הביולוגי ביוכימיים ושיטות physicochemical לזיהוי וכימות של cyanotoxins.

<pclass = "jove_content"> מבחני immunosorbent enzyme-linked (ELISA), מבחני עיכוב פוספט החלבון (PPIA), ובדיקות ועצביות עכברים הם דוגמאות של מבחני מיון ביוכימיים לצורך זיהוי של cyanotoxins. בעוד שתיים הראשונים הם מתודולוגיות מהירים ורגישים, תוצאות חיוביות שגויות תוארו בעת שימוש בדיקות ELISA ו- PPIA מוגבלות לשלושה סוגי רעלים. מבדק העכבר הוא טכניקה איכותית עם רגישות נמוכה ודיוק, ורישוי מיוחד והכשרה נדרשת. בנוסף, זה לא נותן מידע על סוג של רעלים הנמצאים במדגם. Cyanotoxins ניתן מזוהה לכימות על ידי שיטות אנליטיות אחרות, כגון כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים (HPLC), ספקטרומטריית מסה-כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS), גז כרומטוגרפיה (GC), ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסת הגז (GC-MS), או זמן יינון desorption / לייזר בסיוע מטריקס של טיסה (MALDI-TOF). עם זאת, זה אפשרי רק אם סטנדרטי התייחסות, אשר צריךed לקבוע ריכוזי רעלן פרט בדגימות מורכבות, זמין ^{3, 4.} יתר על כן, שיטות אלה הן זמן רב; דורש ציוד, אספקה ​​יקר, הכנת מדגם; וחייבת להתבצע על ידי צוות מנוסה מיוחד.

מולקולריות מבוסס שיטות יושמו במשך עשרות שנים כדי לאתר, לזהות, ולכמת כחוליות ו cyanotoxins המתאים הודות לפרטי הרצף שפורסמו בכתב מסדי הנתונים הגנום (למשל, המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה, צמח שדה). בין השיטות הללו הם אלה המבוססים על תגובת שרשרת פולימרז (PCR), המחייב את העיצוב של סטים של פריימרים עבור הגברת DNA ותלוי ידע קודם של רצפי DNA של מינים כחוליות שונים. בעוד זיהוי הגן, כמו אופרון phycocyanin, מוביל זיהוי מדויק ברמת הסוג, כמה מינים או זנים הם מבלי שיבחינו עםהשיטה הזאת. עם זאת, הגנים המקודדים-טוקסין, כגון השייכים אופרון microcystin, להקל על זיהוי של רעלים בדגימות שבו המפיקים הם נדירים ^5. עם זאת, זיהוי של סמני רעלן ידי PCR אינו מצביע בהכרח רעיל בסביבה. יתר על כן, הקבוצה של פריימרים פותחו כדי לנתח את המגוון השלם של מינים של מפיקים כחוליות ורעלנים נוכחים מדגם שעדיין לא הושלם, ועל מחקרים נוספים צריכים לעשות כדי לזהות מינים שאינם מוכרים. בטכניקות מולקולריות אחרות שאינן PCR מבוססים, כגון קרינת כלאה באתרו (FISH) ואת מערכי DNA.

בטכנולוגית שני העשורים, microarray האחרונים צברה חשיבות בתחומים רבים של יישום, במיוחד ניטור סביבתי. מערכי DNA לאפשר אפליה בין המינים analytes ^{4, 6, 7} </^{sup>, 8, 9, 10,} אבל הם נחשבים מאוד מייגעים זמן רב משימות שכוללות שלבים מרובים (לדוגמא, ביצועי microarray, מיצוי DNA, הגברת PCR, ו כלאה). מסיבה זו, מבחני זמן רבים פחות מבוססים על נוגדנים, כגון כריך microarrays אימונולוגיים התחרותי, הפכו שיטה חיונית ואמינה תפוקה גבוהה לצורך זיהוי של analytes המרובה הסביבתי ^{11, 12, 13.} היכולת של נוגדנים להכיר תרכובות היעד שלהם במיוחד כדי לזהות כמויות קטנות של analytes וחלבונים, יחד עם האפשרות לייצר נוגדנים נגד כמעט כל חומר, להפוך microarrays נוגדן טכניקה רבת עוצמה למטרות סביבתיות. בנוסף, את היכולת להשיג מספר ניתוחי כמוingle assay, עם מגבלות של גילוי החל ppb כדי PPM, הוא אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו ^14.

חיישנים ביולוגיים מבוססי נוגדן הוכיחו להיות כלי רגיש מהירה לצורך זיהוי של מגוון רחב של פתוגנים ורעלים ניטור סביבתי ^{15, 16, 17, 18, 19, 20, 21.} בעוד שיטות DNA כרוכות בכמה שלבים, microarrays מבוסס הנוגדנים דורש רק הכנת מדגם קטנה המבוססת בעיקר על צעד תמוגה קצר חיץ פתרון הולם. Delehanty ו Ligler ¹⁵ דיווחו על זיהוי סימולטני של חלבונים analytes חיידקי בתערובות מורכבות המבוססות על immunoassay כריך נוגדן מסוגל לאתר ריכוז חלבון של 4 ppbד 10 ⁴ CFU / מ"ל של תאים. Szkola et al. ²¹ פתחו microarray זמנית זולה ואמינה עבור זיהוי סימולטני של proteotoxins ורעלים קטנים, תרכובות היכולות לשמש לוחמה ביולוגית. הם זיהו ריכוזים של הרעלן ריצין, עם הגבלה של גילוי של 3 ppb, בתוך פחות מ -20 דקות. לאחרונה, CYANOCHIP, הנוגדן microarray מבוסס biosensor לגילוי באתרו של כחוליות רעילות רעילות, תואר ^22. microarray זה מאפשר זיהוי של פרחים כחוליות פוטנציאל, בעיקר בסביבות מימיות, אשר קשה לזהות מיקרוסקופית. המגבלה של זיהוי של microarray היא 10 ² – 10 תאים ³ עבור רוב המינים, מפנים biosensor זו תוכל להפוך לכלי חסכוני לצורך זיהוי הזמני וזיהוי כחוליות, אפילו ברמת המין. כל המאפיינים הללו להפוך את antiboטכניקת microarray dy, ובמיוחד השיטה המוצגת בעבודה זו, שיטה מהירה ופשוטה יותר לעומת הטכניקות הנ"ל.

היצירה מציגה שתי דוגמאות של ניסויים שמשתמשים biosensor microarray מבוסס נוגדנים כדי לזהות את נוכחותו של כחוליות בדגימות קרקע ומים. זוהי שיטה פשוטה ואמינה המבוססת על פורמט immunoassay כריך הדורשת כרכי מדגם קטנים מאוד הכנת מדגם מאוד בסיסית. השיטה מחייבת זמן קצר והוא יכול להתבצע בקלות בתחום.