Experimenteel protocol voor het opsporen<em> Cyanobacteriën</em> In vloeibare en vaste monsters met een antilichaam Microarray Chip

De detectie en monitoring van micro-organismen in complexe natuurlijke microbiële gemeenschappen zijn van cruciaal belang op vele gebieden, met inbegrip van medische biologie, ecologie van het milieu, en astrobiology. Cyanobacteriën zijn prokaryotische micro- organismen bekend om hun vermogen om bloemen (excessieve proliferatie) van cellen vormen in zoet water. Ze zijn alomtegenwoordig en vele soorten kunnen toxinen produceren, wat niet alleen een risico betekent voor de gezondheid, maar ook een ecologische impact. In dit verband is het essentieel om snelle en gevoelige methode voor de vroege detectie van cyanobacteriën en / of toxinen in grond en water te ontwikkelen. Voor dit doel is een multiplex fluorescerende sandwich microarray immunoassay (FSMI) is ontwikkeld als instrument voor waterbeheerders om hen te helpen bij het maken van beslissingen en, bijgevolg, bij de uitvoering van de juiste water management programma's.

Een breed scala aan methoden ontwikkeld voor het opsporen en identificeren van cyaanobacterial cellen en cyanotoxines in grond en water, zoals optische microscopie, moleculaire biologie, en immunologische technieken. Deze methoden kunnen sterk variëren in de informatie die zij verstrekken. Microscopische technieken zijn gebaseerd op celmorfologie en de detectie van in vivo fluorescentie van cyanobacteriën pigmenten, zoals phycocyanin of chlorofyl a ^1. Hoewel ze zijn snelle en goedkope methoden voor real-time en frequente controle die informeren over de aard en het aantal cyanobacteriën aanwezig is in een monster, hebben ze geen informatie over de mogelijke toxiciteit geven. Bovendien vereisen zij een bepaald niveau van deskundigheid, aangezien het vaak moeilijk om onderscheid te maken tussen nauw verwante soorten ^2. Om deze beperkingen te overwinnen, moet lichtmicroscopie worden begeleid door zowel biologische en biochemische screeningstesten en fysisch-chemische methoden voor de identificatie en kwantificatie van cyanotoxines.

<pclass = "jove_content">-enzyme linked immunosorbent assays (ELISA), eiwit fosfaat remmingstesten (PPIA) en neurochemische bij muizen zijn voorbeelden van biochemische screeningsassays voor de detectie van cyanotoxines. Terwijl de eerste twee zijn snelle en gevoelige methoden zijn valse positieven beschreven bij het gebruik van ELISA en PPIA tests worden beperkt tot drie typen gifstoffen. De muis bioassay is een kwalitatieve techniek met een lage gevoeligheid en precisie, en speciale vergunningen en opleiding vereist. Bovendien is het geen informatie over de aard van de giftige stoffen die aanwezig zijn in een monster te geven. Cyanotoxines kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd andere analytische werkwijzen, zoals hoge-prestatie vloeistofchromatografie (HPLC), vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS), gaschromatografie (GC), gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), of matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie vluchttijd (MALDI-TOF). Dit is echter alleen mogelijk als referentiestandaarden, die nodiged individuele toxine concentraties in complexe monsters te bepalen, zijn ^{3, 4.} Bovendien zijn deze werkwijzen zijn tijdrovend; vereisen dure apparatuur, voorraden en monster voorbereiding; en moeten worden uitgevoerd door ervaren en gespecialiseerde medewerkers.

Moleculair gebaseerde methoden zijn toegepast voor de komende decennia op te sporen, te identificeren en te kwantificeren cyanobacteriën en de bijbehorende cyanotoxines dankzij de sequentie-informatie gepubliceerd in het genoom databases (bv, National Center for Biotechnology Information, NCBI). Onder deze werkwijzen zijn op basis van de polymerasekettingreactie (PCR), waarbij het ontwerp van primersets voor DNA amplificatie vereist en afhankelijk voorkennis van DNA-sequenties van verschillende soorten cyanobacteriën. Terwijl gen detectie, zoals de phycocyanin operon, leidt tot een nauwkeurige identificatie op genus niveau, sommige soorten of stammen zijn onopgemerkt metdeze methode. Echter, toxine-coderende genen, bijvoorbeeld die welke behoren tot de microcystine operon, vergemakkelijken de identificatie van toxines in monsters waar de producenten schaars ^5. Niettemin heeft de detectie van toxine markers door PCR niet noodzakelijkerwijs toxiciteit in het milieu. Bovendien is de set van primers ontwikkeld om het hele scala van soorten cyanobacteriën en toxine producenten aanwezig zijn in een monster te analyseren is nog onvolledig, en verder onderzoek moet worden gedaan om onbekende soorten te identificeren. Andere moleculaire technieken niet PCR-gebaseerde, zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en DNA microarrays.

In de laatste twee decennia heeft microarray technologie aan belang gewonnen op vele toepassingsgebieden, met name in het milieu monitoring. DNA microarrays mogelijk maken onderscheid tussen soorten en analyten ^{4, 6, 7} </^{sup>, 8, 9, 10,} maar ze worden beschouwd als zeer omslachtig en tijdrovend taken die meerdere stappen (bijvoorbeeld microarray prestaties, DNA extractie, PCR amplificatie en hybridisatie) omvatten. Daarom minder tijdrovend assays op basis van antilichamen, zoals sandwich en competitieve immunologische microarrays, een essentieel en betrouwbare high-throughput werkwijze voor de detectie van meerdere analyten milieu ^{11, 12, 13} worden. Het vermogen van antilichamen om specifiek herkennen de doelverbindingen en kleine hoeveelheden analyten en eiwitten te detecteren, samen met de mogelijkheid van het produceren van antilichamen tegen vrijwel alle stoffen, maak antilichaam microarrays een techniek om milieuredenen. Bovendien is de mogelijkheid van het bereiken meerdere analyses alsingle assay, met detectiegrenzen variërend van ppb tot ppm, is een van de belangrijkste voordelen van deze methode ^14.

Antilichamen gebaseerde biosensoren bleken gevoelige en snelle instrumenten voor de detectie van een breed scala van pathogenen en toxinen in milieucontrole ^{15, 16, 17, 18, 19, 20, 21} zijn. Terwijl DNA werkwijzen omvatten verschillende stappen, het op antilichaam gebaseerde microarrays vereisen slechts een kleine steekproef preparaat dat hoofdzakelijk gebaseerd is op een korte lysisstap in een geschikte buffer oplossing. Delehanty en ¹⁵ League Meeste meldde de gelijktijdige detectie van eiwitten en bacteriële analyten in complexe mengsels van een antilichaam sandwich immunoassay voor het opsporen van een eiwitconcentratie van een 4 ppbd 10 ⁴ cfu / ml cellen. Szkola et al. ²¹ is een voordelige en betrouwbare multiplex microarray voor de simultane detectie van proteotoxins en kleine toxines verbindingen die kunnen worden gebruikt als biologisch wapen ontwikkeld. Het gedetecteerde concentraties ricine toxine, met een detectiegrens van 3 ppb, in minder dan 20 minuten. Onlangs heeft de CYANOCHIP een antilichaam microarray-gebaseerde biosensor voor de in situ detectie van toxische en toxische cyanobacteriën beschreven ^22. Dit microarray maakt de identificatie van potentiële cyanobacteriënbloeien, meestal in waterige omgevingen die moeilijk microscopisch identificeren. De detectiegrens van de microarray is ¹⁰ februari – 10 maart cellen voor de meeste soorten, het draaien van deze biosensor in een kosteneffectief instrument voor de multiplex detectie en identificatie van cyanobacteriën, zelfs op het niveau van soorten. Al deze eigenschappen maken de AntiboDY microarray techniek, met name de methode die in dit werk, sneller en eenvoudiger methode dan de bovengenoemde technieken.

Dit werk toont twee voorbeelden van experimenten die een antilichaam microarray gebaseerde biosensor om de aanwezigheid van cyanobacteriën in bodem- en watermonsters te detecteren. Het is een eenvoudige en betrouwbare methode gebaseerd op een immunoassay format dat zeer kleine monsterhoeveelheden en zeer eenvoudige monstervoorbereiding vereist. De werkwijze vereist een korte tijd en kan gemakkelijk worden uitgevoerd in het veld.