بروتوكول تجريبي للكشف<em> البكتيريا الزرقاء</em> في العينات السائلة والصلبة مع الأجسام المضادة ميكروأري رقاقة

كشف ورصد الكائنات الحية الدقيقة في المجتمعات الميكروبية الطبيعية المعقدة حاسمة في العديد من المجالات، بما في ذلك الطب الحيوي والبيئة البيئية، والبيولوجيا الفلكية. البكتيريا الزرقاء هي الكائنات الحية الدقيقة بدائية النواة المعروفة لقدرتها على تشكيل تزهر (الانتشار المفرط) من الخلايا في المياه العذبة. انهم في كل مكان، والعديد من الأنواع قادرة على إنتاج السموم، مما يؤدي ليس فقط إلى خطر محتمل على صحة الإنسان، ولكن أيضا إلى التأثير البيئي. وفي هذا الصدد، لا بد من تطوير أساليب سريعة وحساسة للكشف المبكر من البكتيريا الزرقاء و / أو سمومها في التربة والمياه. لهذا الغرض، تم تطوير تعدد الإرسال الفلورسنت المناعية شطيرة ميكروأري (FSMI) كأداة لإدارة المياه لمساعدتهم في اتخاذ القرارات، وبالتالي، في تنفيذ البرامج المناسبة لإدارة المياه.

وقد تم تطوير مجموعة متنوعة من الطرق لاكتشاف وتحديد السماويخلايا obacterial وcyanotoxins في التربة والمياه، بما في ذلك المجهر الضوئي، والبيولوجيا الجزيئية، والتقنيات المناعية. هذه الأساليب يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا في المعلومات التي يقدمونها. وتعتمد التقنيات المجهرية على شكل الخلية وكشف في الجسم الحي مضان من الأصباغ السيانوبكتيريا، مثل فيكوسيانين أو الكلوروفيل ^{(أ) 1.} على الرغم من أنها طرق سريعة ورخيصة في الوقت الحقيقي والرصد المتكرر لإعلام حول نوع وعدد من البكتيريا الزرقاء الموجودة في عينة، فإنها لا تعطي معلومات حول السمية المحتملة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنها تتطلب مستوى معين من الخبرة، معتبرا أنه غالبا ما يكون من الصعب جدا التمييز بين الأنواع ذات صلة وثيقة ^2. للتغلب على هذه القيود، يجب أن يصاحب ضوء المجهر من قبل كل من فحوصات الكشف البيولوجية والكيميائية الحيوية والطرق الفيزيائية لتحديد وتقدير من cyanotoxins.

<pالطبقة = "jove_content"> انزيم مرتبط المقايسات المناعي (ELISA)، المقايسات البروتين الفوسفات تثبيط (PPIA)، والاختبارات الكيميائية العصبية في الفئران هي أمثلة على المقايسات فحص البيوكيميائية للكشف عن cyanotoxins. في حين أن الأولين هي المنهجيات السريعة والحساسة، وقد وصفت ايجابيات كاذبة عندما يتم تقييد استخدام ELISA وPPIA الاختبارات لثلاثة أنواع من السموم. الأحيائي الماوس تقنية نوعية مع انخفاض الحساسية والدقة، وترخيص خاص والتدريب هو مطلوب. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه لا يعطي معلومات حول نوع من السموم الموجودة في العينة. ويمكن تحديد Cyanotoxins وكميا بواسطة طرق أخرى تحليلية، مثل ارتفاع الأداء اللوني السائل (HPLC)، السائل الطيف اللوني الشامل (LC-MS)، اللوني للغاز (GC)، الغاز اللوني الكتلة الطيفي (GC-MS)، أو مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز الوقت / تأين الطيران (MALDI-TOF). ومع ذلك، وهذا ممكن فقط إذا المعايير المرجعية، والتي تحتاجإد لتحديد تركيز السم الفردية في عينات معقدة، وتتوفر ^{3 و 4.} وعلاوة على ذلك، وهذه الأساليب هي مضيعة للوقت. تتطلب معدات مكلفة، واللوازم، وإعداد العينات. ويجب أن يقوم بها الموظفين ذوي الخبرة والاختصاص.

طبقت على أساس أساليب الجزيئية لعقود من الزمن لكشف وتحديد، وتحديد البكتيريا الزرقاء وcyanotoxins المقابلة شكرهم للمعلومات تسلسل نشرت في قواعد بيانات الجينوم (على سبيل المثال، المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية، NCBI). ومن بين هذه الطرق هي تلك التي تستند إلى تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، الأمر الذي يتطلب تصميم مجموعات من الاشعال لتضخيم الحمض النووي وتعتمد على معرفة سابقة من تسلسل الحمض النووي من الأنواع السيانوبكتيريا مختلفة. في حين كشف الجينات مثل الاوبرون فيكوسيانين، يؤدي إلى تحديد دقيق على مستوى جنس، فإن بعض الأنواع أو السلالات هي التي لم يتم كشفها معهذه الطريقة. ومع ذلك، جينات ترميز السم، مثل أولئك الذين ينتمون إلى الاوبرون microcystin، تسهيل التعرف على السموم في العينات حيث المنتجين شحيحة ^5. ومع ذلك، والكشف عن علامات السمية عن طريق PCR لا يعني بالضرورة سمية في البيئة. وعلاوة على ذلك، فإن مجموعة من الاشعال المتقدمة لتحليل مجموعة كاملة من الأنواع من البكتيريا الزرقاء والسمية المنتجين الحالي في عينة لا يزال غير مكتمل، ويجب أن يتم إجراء المزيد من الدراسات لتحديد أنواع غير معروفة. وغير PCR القائم على التقنيات الجزيئية الأخرى، مثل مضان في الموقع التهجين (FISH) وميكروأرس الحمض النووي.

في العقدين الأخيرين، وقد اكتسبت أهمية تكنولوجيا متطورة في العديد من مجالات التطبيق، لا سيما في مجال الرصد البيئي. ميكروأرس الحمض النووي تسمح للتمييز بين الأنواع والتحاليل ^{4، 6، 7} </^{سوب>، 8، 9، 10،} لكنها نظرت الى شاقة للغاية والمهام التي تنطوي على خطوات متعددة (على سبيل المثال، أداء ميكروأري، واستخراج الحمض النووي، PCR التضخيم، والتهجين) تستغرق وقتا طويلا. لهذا السبب، وأقل فحوصات تستغرق وقتا طويلا بناء على الأجسام المضادة، مثل شطيرة وميكروأرس المناعية تنافسية، وأصبحت وسيلة عالية الإنتاجية أساسي وموثوق بها للكشف عن التحاليل البيئية متعددة ^{11 و 12 و 13.} قدرة الأجسام المضادة لتسلم على وجه المركبات المستهدفة وللكشف عن كميات صغيرة من التحاليل والبروتينات، جنبا إلى جنب مع إمكانية إنتاج الأجسام المضادة ضد مادة تقريبا أي، وجعل المجهرية الضد تقنية قوية للأغراض البيئية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن القدرة على تحقيق متعددة تحلل في مثلإنجل الفحص، مع حدود الكشف بدءا من جزء في البليون إلى PPM، هو واحد من أهم مزايا هذه الطريقة ^14.

وقد أثبتت أجهزة الاستشعار القائمة على أجسام مضادة لتكون أدوات حساسة وسريعة للكشف عن مجموعة واسعة من مسببات الأمراض والسموم في الرصد البيئي ^{15، 16، 17، 18، 19، 20، 21.} بينما الأساليب الحمض النووي تنطوي على عدة خطوات، وميكروأرس القائم على الأجسام المضادة لا تتطلب سوى تحضير عينة صغيرة التي تقوم أساسا على خطوة تحلل قصيرة في وجود مخزن مؤقت الحل المناسب. ذكرت Delehanty وLigler ¹⁵ كشف في وقت واحد من البروتينات والتحاليل البكتيرية في مخاليط معقدة على أساس المناعي الأجسام المضادة شطيرة قادرة على الكشف عن تركيز البروتين من 4 جزء في البليوند 10 ⁴ كفو / مل من الخلايا. SZKOLA وآخرون. وقد وضعت ²¹ ميكروأري متعدد رخيصة ويمكن الاعتماد عليه للكشف في وقت واحد proteotoxins والسموم صغيرة، ومركبات التي يمكن استخدامها في الحرب البيولوجية. أنها اكتشفت تركيزات من مادة الريسين السامة، مع الحد من الكشف عن 3 أجزاء من البليون، في أقل من 20 دقيقة. في الآونة الأخيرة، فقد وصفت CYANOCHIP، وهو جهاز الاستشعار البيولوجي استنادا ميكروأري الأجسام المضادة للفي الموقع كشف عن البكتيريا الزرقاء السامة وغير سام، ^22. هذا ميكروأري يسمح لتحديد تزهر السيانوبكتيريا المحتملة، ومعظمها في البيئات المائية، التي يصعب تحديد مجهريا. الحد من الكشف عن ميكروأري هو ¹⁰ فبراير – 10 مارس خلايا لمعظم الأنواع، وتحول هذا جهاز الاستشعار البيولوجي إلى أداة فعالة من حيث التكلفة للكشف عن تعدد الإرسال وتحديد البكتيريا الزرقاء، حتى على مستوى الأنواع. كل هذه المواصفات تجعل من antiboتقنية ميكروأري دى، وخاصة الطريقة المعروضة في هذا العمل، وهي طريقة أسرع وأبسط مقارنة مع التقنيات المذكورة أعلاه.

يعرض هذا العمل مثالين من التجارب التي تستخدم الأجسام المضادة جهاز الاستشعار البيولوجي القائم على ميكروأري للكشف عن وجود البكتيريا الزرقاء في عينات من التربة والمياه. وهي طريقة بسيطة وموثوق بها على أساس شكل المناعية شطيرة التي تتطلب كميات عينة صغيرة جدا وإعداد نموذج بسيط للغاية. وتتطلب هذه الطريقة وقت قصير ويمكن أن يؤديها بسهولة في هذا المجال.