Protocolo experimental para Detectar<em> Cianobactérias</em> Em amostras líquidas e sólidas com um Microarray Chip Antibody

A detecção e monitorização de microrganismos em comunidades microbianas naturais complexos são cruciais em muitos campos, incluindo a biomedicina, a ecologia ambiental e astrobiologia. As cianobactérias são microrganismos procarióticos bem conhecidos por sua capacidade de formar flores (excessiva proliferação) de células em água doce. Eles estão por toda parte, e muitas espécies são capazes de produzir toxinas, levando não só a um risco potencial para a saúde humana, mas também a um impacto ecológico. A este respeito, é essencial para desenvolver métodos rápidos e sensíveis para a detecção precoce de cianobactérias e / ou suas toxinas no solo e na água. Para este efeito, uma lâmpada fluorescente imunoensaio sanduíche de microarray multiplex (FSMI) foi desenvolvido como uma ferramenta para os gestores da água para ajudá-los na tomada de decisões e, consequentemente, na implementação de programas adequados de gestão da água.

Uma grande variedade de métodos tem sido desenvolvida para detectar e identificar cianocélulas obacterial e cianotoxinas em solo e da água, incluindo a microscopia óptica, biologia molecular e técnicas imunológicas. Esses métodos podem variar muito na informação que fornecem. Técnicas microscópicas são baseadas na morfologia celular e a detecção de fluorescência in vivo a partir de cianobactérias pigmentos, tais como ficocianina ou clorofila a ^1. Embora eles são métodos rápidos e baratos para em tempo real e monitoramento frequente que informam sobre o tipo e número de cianobactérias presentes em uma amostra, eles não dão informações sobre a toxicidade potencial. Além disso, eles exigem um certo nível de especialização, tendo em vista que muitas vezes é muito difícil distinguir entre espécies estreitamente relacionadas ^2. Para superar essas limitações, microscopia de luz deve ser acompanhado de ambos os testes de rastreio biológicas e bioquímicas e métodos físico-químicos para a identificação e quantificação de cianotoxinas.

<pclasse = "jove_content"> Os ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA), ensaios de inibição de fosfato de proteína (PPIA), e ensaios neuroquímicos em ratinhos são exemplos de ensaios de rastreio bioquímicos para a detecção de cianotoxinas. Enquanto os dois primeiros são metodologias rápidos e sensíveis, os falsos positivos quando foram descritos por meio de testes de ELISA e PPIA estão restritos a três tipos de toxinas. O bioensaio em ratos é uma técnica qualitativa com baixa sensibilidade e precisão, e licenciamento especial e treinamento é necessário. Além disso, ela não dá informações sobre o tipo de toxinas presentes numa amostra. Cianotoxinas podem ser identificados e quantificados por outros métodos analíticos, tais como a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), espectrometria de líquido de cromatografia de massa (LC-MS), cromatografia gasosa (GC), cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS), ou laser tempo de dessorção / ionização assistida por matriz de voo (MALDI-TOF). No entanto, isso só é possível se os padrões de referência, que são necessidadeed para determinar as concentrações de toxinas individuais em amostras complexas, estão disponíveis ^{3, 4.} Além disso, estes métodos são demorados; exigem equipamentos caros, suprimentos e preparação de amostras; e deve ser realizada por pessoal experiente e especializado.

Métodos moleculares baseados em ter sido aplicada há décadas para detectar, identificar e quantificar as cianobactérias e cianotoxinas seus correspondentes graças à informação da sequência publicada nas bases de dados do genoma (por exemplo, National Center for Biotechnology Information, NCBI). Entre estes métodos são aquelas com base na reacção em cadeia da polimerase (PCR), que exige a concepção de conjuntos de iniciadores para a amplificação de ADN e dependem do conhecimento prévio de sequências de DNA de diferentes espécies de cianobactérias. Embora a detecção de genes, como o operon ficocianina, leva à identificação precisa no nível de gênero, algumas espécies ou estirpes são detectadas comeste método. No entanto, os genes que codificam toxinas, tais como as que pertencem ao operão microcistina, facilitaria a identificação de toxinas nas amostras em que os produtores são escassos ^5. No entanto, a detecção de marcadores de toxina por PCR não implica necessariamente a toxicidade no ambiente. Além disso, o conjunto de primers desenvolvidos para analisar toda a gama de espécies de cianobactérias e de toxina produtores presentes em uma amostra ainda está incompleta, e novos estudos devem ser feitos para identificar espécies desconhecidas. Outras técnicas moleculares são não-PCR à base, tais como hibridação in situ fluorescente (FISH) e microarranjos de DNA.

Nas últimas duas décadas, a tecnologia de microarray ganhou importância em muitos campos de aplicação, especialmente no monitoramento ambiental. Microarranjos de DNA permitem a discriminação entre espécies e analitos ^{4, 6, 7} </^{sup>, 8, 9, 10,} mas elas são consideradas muito trabalhoso e tarefas que envolvem múltiplos passos (por exemplo, o desempenho de microarray, extracção de ADN, amplificação por PCR e hibridação) demorado. Por essa razão, menos ensaios morosos baseados em anticorpos, tais como micromatrizes sanduíche e imunológicas competitivas, tornaram-se um método essencial e fiável de elevado rendimento para a detecção de múltiplos analitos ambientais ^{11, 12, 13.} A capacidade dos anticorpos para reconhecer especificamente os seus compostos-alvo e a detecção de pequenas quantidades de analitos e proteínas, juntamente com a possibilidade de produzir anticorpos contra praticamente qualquer substância, fazer micromatrizes de anticorpo uma técnica poderosa para fins ambientais. Além disso, a capacidade de atingir múltiplas análises em tãoingle ensaio, com limites de detecção na gama de ppb a ppm, é uma das principais vantagens deste método ^14.

Biossensores baseados em anticorpos provaram ser ferramentas sensíveis e rápidos para a detecção de uma ampla gama de patogénios e toxinas na monitorização ambiental ^{15, 16, 17, 18, 19, 20, 21.} Enquanto os métodos de DNA envolve várias etapas, os microarrays à base de anticorpos só exigem uma preparação de amostra pequena que é baseado principalmente em uma etapa curta lise num tampão solução adequada. Delehanty Ligler e ¹⁵ relataram a detecção simultânea de analitos e proteínas bacterianas em misturas complexas com base em um imunoensaio sanduíche de anticorpo capaz de detectar uma concentração de proteína de uma 4 ppbd 10 ⁴ cfu / mL de células. Szkola et ai. ²¹ desenvolveram uma micromatriz multiplex barato e fiável para a detecção simultânea de pequenas proteotoxins e toxinas, compostos que pode ser utilizado em armas biológicas. Eles detectadas concentrações de toxina de ricina, com um limite de detecção de 3 ppb, em menos de 20 min. Recentemente, o CYANOCHIP, um biossensor baseado em microarray de anticorpos para a detecção in situ de cianobactérias tóxico e não tóxico, tem sido descrito ^22. Este microarray permite a identificação de potenciais florações de cianobactérias, principalmente em ambientes aquáticos, que são difíceis de identificar microscopicamente. O limite de detecção do microarray é de 10 ^{marco 02-10} células para a maioria das espécies, transformando este biossensor em uma ferramenta eficaz para a detecção multiplex e identificação de cianobactérias, mesmo ao nível de espécie. Todas essas propriedades fazem o Antibody técnica de microarray, e particularmente o método apresentado neste trabalho, um método mais rápido e mais simples em comparação com as técnicas acima mencionadas.

Este trabalho apresenta dois exemplos de experiências que utilizam um biossensor baseado em microarray de anticorpos para detectar a presença de cianobactérias, em amostras de solo e água. É um método simples e confiável com base em um formato de imunoensaio sanduíche que exige muito pequenos volumes de amostras e preparação muito básico amostra. O método requer um curto período de tempo e pode ser facilmente realizada no campo.