Saptamak için deneysel protokol<em> Siyanobakteri</em> Bir Antikor Mikroarray Chip ile Sıvı ve Katı Örneklerinde

algılama ve karmaşık doğal mikrobiyal topluluklar mikroorganizmaların izlenmesi biyomedikal, çevre ekoloji ve Astrobiyoloji dahil olmak üzere birçok alanda, son derece önemlidir. Taze su içinde hücre çoğalması (aşırı çoğalması) oluşturmak için yetenekleri açısından iyi bilinen prokaryotik mikroorganizma Siyanobakteriler bulunmaktadır. Bunlar her yerde vardır, ve birçok türün insan sağlığı için potansiyel bir risk değil, aynı zamanda bir ekolojik etkisi sadece lider, toksinler üretebiliriz. Bu bağlamda, siyanobakteriler ve / veya toprak ve su içinde toksinlerin erken teşhisi için hızlı ve hassas bir yöntem geliştirmek gereklidir. Su yöneticileri uygun su yönetim programlarının uygulanmasında, dolayısıyla karar verme onlara yardım ve bu amaçla, bir multipleks floresan sandviç mikrodizi immunoassay (FSMI) bir araç olarak geliştirilmiştir.

yöntemler çeşitli bir yelpazede algılamak ve mavi tanımlamak için geliştirilmiştirOptik mikroskopi, moleküler biyoloji, ve immünolojik teknikler de dahil olmak üzere toprak ve su içinde obacterial hücreleri ve cyanotoxins. Bu yöntemler sağladıkları bilgiler büyük ölçüde değişebilir. Mikroskopik teknikler, hücre morfolojisi ve phycocyanin olarak siyanobakteri pigmentler arasında in vivo olarak floresans algılama ya da ¹ klorofil dayanmaktadır. Onlar türü ve bir numunede mevcut Siyanobakterinin sayısı hakkında bilgi gerçek zamanlı ve sık izlenmesi için hızlı ve ucuz yöntemler olmasına rağmen, onlar potansiyel toksisitesi ile ilgili bilgi vermemektedir. Buna ek olarak, genellikle yakın türler ² ayırt etmek zor olduğu göz önünde, uzmanlık belirli bir düzeyde gerekir. Bu sınırlamaları aşmak için, ışık mikroskobu, biyolojik ve biyokimyasal tarama deneyleri ve cyanotoxins tanımlanması ve ölçümü için fizikokimyasal yöntemlerle hem eşlik etmelidir.

<pSınıf = "jove_content"> enzim bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA), protein fosfat inhibisyonu tahlilleri (PPIA), ve farelerde nöro-kimyasal testler cyanotoxins saptanması için biyokimyasal tarama deneyleri örnekleridir. İlk iki hızlı ve duyarlı bir metodolojileri iken kullanılarak ELISA ve PPIA testleri toksinler üç tip ile sınırlı olduğunda, yanlış pozitif tarif edilmiştir. Fare biyoassay gerekli düşük duyarlılık ve hassasiyet, ve özel lisanslama ve eğitim ile niteliksel bir tekniktir. Buna ek olarak, bir numunede mevcut olan toksinlerin türü hakkında bilgi vermemektedir. Cyanotoxins tanımlanır ve bu, yüksek performanslı sıvı kromatografisi gibi analitik yöntemler (HPLC), sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi ile tayin edilebilir (LC-MS), gaz kromatografisi (GC), gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (GC-MS), veya matris destekli lazer çıkarma / iyonlaşma uçuş süresi (MALDI-TOF). referans standartları, gerek hangi Ancak, bu mümkündürKarmaşık numuneler bireysel toksin konsantrasyonlarını belirlemek için baskı, ^{3, 4} mevcuttur. Ayrıca, bu metodlar zaman alıcıdır; pahalı ekipman, sarf malzemeleri ve numune hazırlık gerektirir; deneyimli ve uzman personel tarafından yapılmalıdır.

Moleküler tabanlı yöntemler genom veritabanlarında yayınlanan dizi bilgiler sayesinde, tespit belirlemek ve siyanobakteri ve bunlara karşılık gelen cyanotoxins ölçmek için yıllardır uygulanmış olan (örneğin, Biyoteknoloji Bilgi, NCBI Ulusal Merkezi). Bu yöntemler arasında, DNA amplifikasyonu için primerlerin setleri tasarım gerektirir ve farklı siyanobakteri türlerinin DNA dizileri önceki bilgiye dayanır, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) dayalı olanlardır. Gen tespiti, phycocyanin operon gibi, cins düzeyinde doğru tanımlama yol açarken, bazı türler veya suşları ile algılanmayan olanBu method. Bununla birlikte, bu mikrosistin operon ait olanlar gibi, toksin kodlayıcı genleri, üretici ⁵ kıt örneklerde toksinlerin belirlenmesini kolaylaştırmaktadır. Yine de, PCR ile toksin işaretlerinin saptanması gerekli ortamında toksisite anlamına gelmez. Ayrıca, bir numunede bulunan siyanobakteri ve toksin üretici türlerinin dizi analiz için geliştirilmiş primerler kümesi hala eksik ve ileri çalışmalar bilinmeyen türler tanımlamak için yapılmalıdır. Diğer moleküler teknikler in situ hibridizasyon (FISH) ve DNA mikrodizileri floresan olarak, PCR-olmayan dayanmaktadır.

son yirmi yılda, mikrotertip teknolojisi, özellikle çevresel izleme, uygulama birçok alanda önem kazanmıştır. DNA mikroarray'ler türler ve analit ^{4 ayrımı, 6, 7} izin </^{sup>, 8, 9, 10,} fakat çok zahmetli ve zaman alan bir çok adım (örneğin, mikro-dizi performansı, DNA izolasyonu, PCR amplifikasyonu ve hibridizasyon) işlerde olarak kabul edilir. Bu nedenle, bu tür bir sandviç ve rekabetçi immünolojik microarrays gibi antikorlar, göre daha az zaman alan deneyler, çoklu ortam analitler ^{11, 12, 13} tespit edilmesi için gerekli bir güvenilir ve yüksek verimli bir yöntem olmuştur. Antikorların yeteneği özel hedef bileşikleri tanıyan ve hemen hemen her maddeye karşı antikorların üretilmesi olasılığı ile birlikte, analit ve proteinlerin küçük miktarlarda tespit etmek için, antikoru mikrodizilerinde Çevre amaçlar için güçlü bir yöntem tercih. Buna ek olarak, birden fazla sağlama yeteneği olarak analizIngle deneyi, ppm ppb'ye kadar algılama sınırları ile bu yöntem ¹⁴ ana avantajlarından biridir.

Antikor-biyosensörler çevresel izleme ^{15, 16, 17, 18, 19, 20, 21} patojen ve zehirli geniş saptanması için, hassas ve hızlı bir araçlar olduğu kanıtlanmıştır. DNA yöntemleri çeşitli adımlar içerir birlikte, antikor bazlı mikrodizileri, yalnızca, uygun bir tampon çözelti kısa bir parçalama adımında dayanan küçük bir örnek hazırlık gerektirir. Delehanty ve Ligler ¹⁵ 4 ppb An bir protein konsantrasyonu tespit edebilen bir antikor sandviç bağışıklık tahlili göre protein ve kompleks karışımlar bakteriyel analitlerin eşanlı deteksiyonunu raporD 10 ⁴ cfu / hücrelerin ml. Szkola ve ark. ²¹ biyolojik savaş kullanılan olabilir proteotoxins ve küçük toksin, bileşiklerin birinin eş zamanlı saptanması için ucuz ve güvenilir bir çoklu mikrodizisi geliştirdik. Onlar az 20 dakika içinde 3 ppb, algılama limitli, risin toksin konsantrasyonları tespit edildi. Son zamanlarda, CYANOCHIP, zehirli ve toksik olmayan siyanobakteriler saptanması için bir antikor mikroarray bazlı biyosensör, ²² tarif edilmiştir. Bu mikrodizi çoğunlukla mikroskobik tespit etmek zordur sucul ortamlarda, potansiyel Siyanobakteri sahası belirlenmesi için izin verir. Hatta tür seviyesinde, çok katlı algılama ve siyanobakteri tanımlanması için düşük maliyetli bir araç haline Bu biyosensör dönüm çok türün 10 ³ hücreleri, – mikrodizisinin tespit limiti 10 ^{2 'dir.} Bütün bu özellikler Antibo haledy mikrodizi tekniği ve bu çalışmada sunulan özel yöntem daha hızlı ve daha basit bir yöntem, söz konusu tekniklere göre.

Bu çalışma, toprak ve su örneklerinde Siyanobakterinin varlığını tespit etmek bir antikor mikroarray tabanlı biyosensör kullanmak deney iki örneklerini sunar. Çok küçük örnek hacimleri ve çok temel örnek hazırlama gerektiren bir sandviç immunoassay biçimine dayanan basit ve güvenilir bir yöntemdir. yöntem, kısa bir süre gerektirir ve kolay bir alanda gerçekleştirilebilir.