Экспериментальный протокол для обнаружения<em> Цианобактерии</em> В жидких и твердых образцах с антителом Microarray Chip

Обнаружение и мониторинг микроорганизмов в сложных природных микробных сообществ играют решающую роль во многих областях, в том числе биомедицины, экологии окружающей среды, и астробиологии. Цианобактерии являются прокариотические микроорганизмы хорошо известны своей способностью образовывать водорослей (избыточное разрастание) клеток в пресной воде. Они повсеместно распространены, и многие виды способны производить токсины, что приводит не только к потенциальному риску для здоровья человека, но и к экологическому воздействию. В связи с этим необходимо разработать быстрые и чувствительные методы раннего обнаружения цианобактерий и / или их токсинов в почве и воде. Для этого, мультиплекс флуоресцентный сэндвич микрочипов иммуноферментного анализа (FSMI) был разработан в качестве инструмента по управлению водными ресурсами, чтобы помочь им в принятии решений и, следовательно, в реализации программ по обеспечению надлежащего управления водными ресурсами.

Разнообразные методы были разработаны для обнаружения и идентификации Cyanobacterial клетки и цианотоксины в почве и воде, в том числе оптической микроскопии, молекулярной биологии и иммунологических методов. Эти методы могут значительно отличаться по информации, которую они предоставляют. Микроскопические методы основаны на клеточной морфологии и детекции флуоресценции в естественных условиях из цианобактерий пигментов, таких как фикоцианина или хлорофилл а ^1. Несмотря на то, что они быстрые и дешевые методы в режиме реального времени и частого мониторинга , которые информируют о типе и количестве цианобактерии , присутствующих в образце, они не дают информации о потенциальной токсичности. Кроме того, они требуют определенного уровня знаний, принимая во внимание , что часто бывает очень трудно провести различие между близкородственными видами ^2. Чтобы преодолеть эти ограничения, световая микроскопия должна сопровождаться как биологических, так и биохимических методов скрининга и физико-химических методов для идентификации и количественного определения цианотоксины.

<pкласс = "jove_content"> иммуноферментного анализа (ELISA), ингибирование белка фосфат анализы (PPIA) и нейрохимические тесты на мышах, являются примерами биохимических анализов скрининга для выявления цианотоксины. В то время как первые два быстрых и чувствительных методологий, ложных срабатываний были описаны при использовании тестов ELISA и PPIA ограничены тремя типами токсинов. Биоанализа мыши качественный метод, с низкой чувствительностью и точностью, а также специального лицензирования и подготовки не требуется. Кроме того, он не дает информации о типе токсинов, присутствующих в образце. Цианотоксины могут быть идентифицированы и количественно другими аналитическими методами, такими как высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), жидкостная хроматография-масс-спектрометрии (ЖХ-МС), газовой хроматографии (ГХ), газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС), или матрицы-активированная лазерная время десорбцией / ионизацией полета (MALDI-TOF). Однако это возможно только при условии ссылки на стандарты, которые должные изд , чтобы определить индивидуальные концентрации токсина в сложных образцах, доступны ^{3, 4.} Кроме того, эти методы требуют больших затрат времени; требует дорогостоящего оборудования, расходных материалов и подготовки проб; и должны выполняться опытным и специализированным персоналом.

Молекулярные методы , основанные применялись на протяжении десятилетий , чтобы обнаружить, идентифицировать и количественно оценить цианобактерии и соответствующие им цианотоксины благодаря информации о последовательности , опубликованной в базах данных генома (например, Национальный центр информации по биотехнологии, NCBI). Среди этих методов являются те, которые основаны на полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая требует разработки наборов праймеров для амплификации ДНК и зависят от предыдущих знаний последовательностей ДНК различных видов цианобактерий. В то время как обнаружение гена, как Фикоцианин оперона, приводит к точной идентификации на уровне рода, некоторые виды или штаммы незамеченной сЭтот метод. Тем не менее, токсин , кодирующие гены, такие как те , которые принадлежат к микроцистина оперона, облегчить идентификацию токсинов в образцах , где производители не хватает ^5. Тем не менее, обнаружение маркеров токсина с помощью ПЦР, не обязательно означает, токсичность в окружающей среде. Кроме того, набор праймеров , разработанных для анализа целого ряда видов цианобактерий и токсинов производителей , присутствующих в образце еще не завершен, и дальнейшие исследования должно быть сделано для выявления неизвестных видов. Другие молекулярные методы , не основанные на ПЦР, таких как флуоресценции в гибридизация (FISH) и ДНК – микрочипов в.

В последние два десятилетия, микрочипов технология приобрела значение во многих областях применения, в частности, в области экологического мониторинга. ДНК – микрочипов допускают дискриминации между видами и аналитов ^{4, 6, 7} , </^{SUP>, 8, 9, 10,} но они считаются очень трудоемкий и занимает много времени задачи, связанные с нескольких шагов (например, производительность микрочипов, экстракции ДНК, ПЦР – амплификации и гибридизации). По этой причине, меньше времени анализы на основе антител, таких как сэндвич и конкурентных иммунологических микрочипов, стали важным и надежным методом с высокой пропускной способностью для обнаружения многочисленных экологических аналитов ^{11, 12, 13.} Способность антител к специфически распознают их целевых соединений и для обнаружения малых количеств аналитов и белков, а также с возможностью получения антител против практически любого вещества, делают Microarrays антитела мощную технику для экологических целей. Кроме того, способность достижения мультипликатор анализов в качествеIngle анализ, с пределами обнаружения в диапазоне от миллиардных долей до миллионных долей, является одним из основных преимуществ этого метода ^14.

Биосенсоры на основе антител, оказались чувствительными и быстрые инструменты для обнаружения широкого спектра патогенных микроорганизмов и токсинов в области экологического мониторинга ^{15, 16, 17, 18, 19, 20, 21.} В то время как методы ДНК включать несколько стадий, микрочипов на основе антител требуют лишь небольшой подготовки образца, который в основном базируется на коротком этапе лизиса в соответствующем буферном растворе. Delehanty и Ligler ¹⁵ сообщили одновременного обнаружения белков и бактериальных аналитов в сложных смесей на основе сэндвич – иммуноанализа антител , способный регистрировать концентрацию белка 4 частей на миллиард А.Н.d 10 ⁴ КОЕ / мл клеток. Szkola и др. ²¹ разработали дешевый и надежный мультиплекс микрочипов для одновременного обнаружения proteotoxins и мелких токсинов, соединений , которые могут быть использованы в биологической войне. Они обнаружили концентрации рицина токсина, с пределом обнаружения 3 частей на миллиард, менее чем за 20 мин. В последнее время CYANOCHIP, антитело микрочипов на основе биосенсора для на месте залегания обнаружения токсичных и нетоксичных цианобактерий, был описан ^22. Это микрочипов позволяет идентифицировать потенциальных расцветает цианобактерий, преимущественно в водной среде, которые трудно идентифицировать микроскопически. Предел обнаружения микрочипа составляет 10 ² – 10 ³ клеток для большинства видов, превращая этот биосенсор в экономически эффективным инструментом для мультиплекса обнаружения и идентификации цианобактерий, даже на уровне отдельных видов. Все эти свойства делают antiboDy техника микрочипов, и в частности, метод, представленный в данной работе, более быстрый и простой способ по сравнению с вышеупомянутыми методами.

В работе представлены два примера экспериментов , которые используют антитела микрочипов биосенсора для обнаружения присутствия цианобактерий в почвенных и водных проб. Это простой и надежный метод, основанный на формате сэндвич иммунологического анализа, который требует очень небольших объемов образцов и очень простой подготовки образцов. Метод требует короткого времени, и может быть легко выполнено в полевых условиях.