Protocollo sperimentale per il rilevamento<em> cianobatteri</em> In campioni liquidi e solidi con un anticorpo Microarray chip

Il rilevamento e il monitoraggio dei microrganismi in complesse comunità microbiche naturali sono fondamentali in molti campi, tra cui la biomedicina, l'ecologia ambientale, e astrobiologia. I cianobatteri sono microrganismi procarioti ben noti per la loro capacità di formare fioriture (eccessiva proliferazione) delle cellule in acqua dolce. Essi sono onnipresenti, e molte specie sono in grado di produrre tossine, che porta non solo ad un potenziale rischio per la salute umana, ma anche ad un impatto ecologico. A questo proposito, è essenziale sviluppare metodi rapidi e sensibili per la diagnosi precoce di cianobatteri e / o loro tossine nel suolo e acqua. A questo scopo, una fluorescente immunodosaggio a sandwich microarray multiplex (FSMI) è stato sviluppato come strumento per gestori delle risorse idriche per aiutarli a prendere decisioni e, di conseguenza, nella realizzazione dei programmi di gestione dell'acqua corretta.

Una vasta gamma di metodi è stato sviluppato per rilevare e identificare cianocellule obacterial e cianotossine nel suolo e acqua, tra cui la microscopia ottica, la biologia molecolare e tecniche immunologiche. Questi metodi possono variare notevolmente nelle informazioni che forniscono. Tecniche microscopiche sono basate sulla morfologia cellulare e la rilevazione della fluorescenza in vivo da pigmenti cianobatteri, come phycocyanin o clorofilla a ^1. Anche se sono metodi rapidi ed economici per il tempo reale e il monitoraggio frequente che a seconda del tipo e del numero di cianobatteri presenti in un campione, non danno informazioni sulla potenziale tossicità. Inoltre, essi richiedono un certo livello di esperienza, considerando che spesso è molto difficile distinguere tra specie strettamente collegate ^2. Per superare queste limitazioni, la microscopia ottica deve essere accompagnata da entrambi i test di screening biologici e biochimici e metodi fisico-chimiche per l'identificazione e la quantificazione di cianotossine.

<pclass = "jove_content"> enzimatico analisi immunoassorbimento (ELISA), test di inibizione della proteina fosfato (PPIA), e le prove neurochimiche nei topi sono esempi di test di screening biochimici per la rilevazione di cianotossine. Mentre i primi due sono metodologie rapide e sensibili, i falsi positivi sono stati descritti quando si utilizzano test ELISA e PPIA sono limitati a tre tipi di tossine. Il biotest sui topi è una tecnica qualitativa con una bassa sensibilità e precisione, e le licenze speciali e la formazione è necessaria. Inoltre, non dà informazioni sul tipo di tossine presenti in un campione. Cianotossine possono essere identificati e quantificati con altri metodi analitici, come la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC), la spettrometria di cromatografia-massa liquida (LC-MS), gas cromatografia (GC), spettrometria di cromatografia di massa di gas (GC-MS), o matrice assistita laser tempo desorbimento / ionizzazione di volo (MALDI-TOF). Tuttavia, questo è possibile solo se gli standard di riferimento, che sono bisognoEd per determinare le concentrazioni di tossine individuali in campioni complessi, sono disponibili ^{3, 4.} Inoltre, questi metodi sono molto tempo; richiedono attrezzature costose, forniture, e la preparazione del campione; e deve essere eseguita da personale esperto e specializzato.

Metodi molecolari basati sono stati applicati per decenni per rilevare, identificare e quantificare cianobatteri e loro cianotossine corrispondenti grazie alle informazioni di sequenza pubblicata nelle banche dati del genoma (ad esempio, National Center for Biotechnology Information, NCBI). Tra questi metodi sono quelli basati sulla reazione a catena della polimerasi (PCR), che richiede la definizione di serie di primer per l'amplificazione del DNA e dipendono dalla precedente conoscenza della sequenza di DNA di diverse specie di cianobatteri. Mentre la rilevazione del gene, come l'operone phycocyanin, porta ad accurata identificazione a livello di genere, alcune specie o ceppi sono rilevati conquesto metodo. Tuttavia, geni della tossina codificanti, come quelle appartenenti alla operone microcystin, facilitare l'identificazione di tossine in campioni in cui i produttori sono scarsi ^5. Tuttavia, la rilevazione dei marcatori tossina mediante PCR non implica necessariamente tossicità nell'ambiente. Inoltre, la serie di primer sviluppati per analizzare l'intera gamma di specie di cianobatteri produttori e tossiche presenti in un campione è ancora incompleta, e ulteriori studi deve essere fatto per identificare specie sconosciute. Altre tecniche molecolari sono non-PCR-based, come ibridazione in situ fluorescente (FISH) e DNA microarray.

Negli ultimi due decenni, la tecnologia microarray ha acquisito importanza in molti campi di applicazione, in particolare nel monitoraggio ambientale. DNA microarray consentono di discriminazione tra le specie e gli analiti ^{4, 6, 7} </^{sup>, 8, 9, 10,} ma sono considerati molto laborioso e richiede tempo compiti che coinvolgono più passaggi (ad esempio, prestazioni microarray, estrazione DNA, amplificazione PCR e ibridazione). Per questo motivo, meno saggi in termini di tempo basati su anticorpi, come panino e microarrays immunologici competitivi, sono diventati un metodo essenziale e affidabile ad alta produttività per la rilevazione di più analiti ambientali ^{11, 12, 13.} La capacità degli anticorpi di riconoscere specificamente i loro composti target e rilevare piccole quantità di analiti e proteine, insieme alla possibilità di produrre anticorpi contro quasi ogni sostanza, rendono microarrays dell'anticorpo una tecnica potente per scopi ambientali. Inoltre, la capacità di realizzare analisi multiple comeassay ingle, con limiti di rilevazione vanno da ppb a ppm, è uno dei principali vantaggi di questo metodo ^14.

Biosensori basati su anticorpi sono dimostrati strumenti sensibili e rapidi per la rilevazione di una vasta gamma di patogeni e tossine nel monitoraggio ambientale ^{15, 16, 17, 18, 19, 20, 21.} Mentre i metodi del DNA coinvolgono diversi passaggi, i microarray a base di anticorpi richiedono solo una piccola preparazione del campione che si basa principalmente su un gradino lisi breve in un buffer soluzione adeguata. Delehanty e Ligler ¹⁵ riportato la rilevazione simultanea di proteine e analiti batteriche in miscele complesse sulla base di un test immuno-anticorpi a sandwich in grado di rilevare una concentrazione proteica di 4 ppb und 10 ⁴ cfu / ml di cellule. Szkola et al. ²¹ hanno sviluppato un buon mercato e affidabile multiplex microarray per la rilevazione simultanea di proteotoxins e piccoli tossine, composti che possono essere utilizzati nella guerra biologica. Essi rivelò concentrazioni di tossina ricina, con un limite di rilevamento di 3 ppb, in meno di 20 min. Recentemente, la CYANOCHIP, un biosensore basato microarray anticorpi per il rilevamento in situ di cianobatteri tossici e non tossico, è stato descritto ^22. Questo microarray consente l'identificazione di potenziali fioriture di cianobatteri, soprattutto in ambienti acquatici, che sono difficili da identificare microscopicamente. Il limite di rilevazione del microarray è di 10 ^{marzo 2-10} cellule per la maggior parte delle specie, trasformando questo biosensore in uno strumento conveniente per il rilevamento e l'identificazione multiplex di cianobatteri, anche a livello di specie. Tutte queste caratteristiche rendono il Antibotecnica microarray dy, e in particolare il metodo presentato in questo lavoro, un metodo rapido e più semplice rispetto alle tecniche citate.

Questo lavoro presenta due esempi di esperimenti che utilizzano un biosensore microarray anticorpi per rilevare la presenza di cianobatteri in campioni di suolo e acqua. Si tratta di un metodo semplice ed affidabile basato su un formato di immunodosaggio a sandwich che richiede volumi di campioni molto piccoli e preparazione del campione molto semplice. Il metodo richiede poco tempo e può essere facilmente eseguita nel campo.