Summary

Мезенхимальных стромальных Культура клеток и доставки в аутологичных условиях: Интеллектуальный подход для протезных применений

Published: December 08, 2016
doi:

Summary

Культивирование человеческих клеток мезенхимальных стромальных (hMSCs) с аутологичной сыворотки, снижает риск отторжения от ксеногенного материала и других негативных последствий. Она также позволяет для восстановления подмножества мезодермальных предшественниках, которые могут доставить свежие hMSCs. Встраивание hMSCs в аутологичных фибринового сгустка обеспечивает простой и эффективной хирургической имплантации.

Abstract

Человеческие клетки мезенхимальных стромальных (hMSCs) культивировали в пробирке с различными средами. Ограничения на их использование в клинических условиях, однако, в основном зависит от потенциальных биологически опасных и воспаление рисков, оказываемого ксеногенных питательными веществами для их культуры. Человеческие производные или рекомбинантные материалы являются первыми кандидатами выбор, чтобы уменьшить эти реакции. Таким образом, культура добавки и материалы аутологичных происхождения представляют лучшие питательные вещества и безопасные продукты.

Здесь мы опишем новый протокол для изоляции и культуры hMSCs костного мозга в аутологичных условиях, а именно – пациента происхождения сыворотки в качестве дополнения для культуральной среды и фибрина в качестве каркаса для введения hMSC. В самом деле, hMSC / фибринового сгустка конструкции могут быть чрезвычайно полезны для нескольких клинических применений. В частности, мы ориентируемся на их использование в ортопедической хирургии, где тромб фибрина происходит от собственной крови донора разрешеноэффективной доставки клеток и питательных веществ / отходов обмены. Для обеспечения оптимальных условий безопасности, это крайне важно, чтобы избежать риска трансформации hMSC и разрастание ткани. По этим причинам подход , описанный в этой статье также указывает на минимально ех естественных условиях hMSC расширения, для уменьшения клеточного старения и морфологические изменения, а также краткосрочный костно-дифференциацию перед имплантацией, чтобы побудить остеогенной спецификации клонов, тем самым снижая риск последующего неконтролируемого пролиферации.

Introduction

Человек мезенхимальных стромальных клеток (hMSCs) представляют собой один из лучших источников клеток для использования в тканевой инженерии для содействия остеогенез 1,2. Они легко выделены из костного мозга и других тканей взрослого, и выражают типичные поверхностные маркеры , такие как CD90, CD105, CD73 1. Более того, они могут дифференцироваться в несколько типов клеток, таких как остеобласты, хондроциты и адипоциты 3. Их терапевтический эффект объясняется их регенеративных и трофических свойств 4. hMSCs можно было бы использовать в ортопедической хирургии, а также в других регенеративных клинических применений. Их предпочтительно в сочетании с подмостей, чтобы улучшить клинический исход 5.

По сравнению с другими материалами, гель – фибрин показывает интересные свойства , такие как липкостью, резорбции и эффективной транспортировки питательных веществ, что делает его чрезвычайно полезным для различных тканевой инженерии 6,7.

<p cдеваха = "jove_content"> Основной задачей в переводе инженерный подход ткани в клинических применений является получение полностью биосовместимого и BIOSAFE эшафот и Xeno свободной культуральной среде, которая позволяет избежать любой инфекционный или реактивную эффект.

В нашем методе фибринового геля, полученного из собственной крови пациента, и аутологичной сыворотки, для культивирования в пробирке hMSCs, были использованы в качестве возможного терапевтического раствора в ортопедической области 8.

Для клинических целей hMSCs, как правило , управляются с помощью двух основных процедур: (I) процедуры "одностадийного" (т.е. минимальное манипуляции), что позволяет автоматическое пересадка костного мозга, либо полностью или концентрированные (т.е. мононуклеары), во время операции; и (II) , процедура "двухстадийный" (то есть, обширные манипуляции), который основан на экс виво расширения hMSCs , чтобы увеличить их урожайность до имплантации, и требует GMP 9 объектов. Интересно отметить , что культивированием клеток с взрослого человека сыворотки вместо коровьей сыворотки теленка позволяет извлекать вместе с hMSCs, подмножества клеток (1 – 10% в мононуклеарных культурах) , называемые Мезодерма клетки – предшественники (ПДК), которые способны дифференцироваться в пробирке в пресную hMSCs 10,11. Таким образом, hMPCs может играть существенную роль в восстановительном процессе, по сравнению с только 12,13 hMSCs. И, наконец, краткосрочные костно-индукционная толкает hMSCs , чтобы начать их дифференцировки в остеогенной линии без потери их пролиферативный потенциал и жизнеспособность 12. Эти результаты подтверждают предыдущие исследования, которые сообщили усиливается в естественных условиях формирования костной ткани с помощью hMSCs, а затем с помощью предкультурой в остеогенной среде 14. К тому же , аутологичной сгустка плазмы , как помост для доставки клеток можно легко манипулировать с помощью хирурга и формованные , чтобы соответствовать форме кости полости 13.

Therefore, этот метод может быть очень полезным для тех исследователей и врачей, которые направлены на перевод их hMSC терапии на основе от скамьи к постели больного в ортопедической практике.

Protocol

Настоящий протокол был разработан в соответствии с декларацией Всемирной медицинской ассоциации Хельсинки относительно этического поведения исследований с участием людей. Он был одобрен Комитетом по этике Azienda Оспедальеро-Universitaria Pisana путем. ЗАМЕТКА: Костный мозг был получен у пациентов , проходивших рутинную тотального эндопротезирования тазобедренного сустава (согласно пункту 1.1) 15; Плазма для приготовления сгустка получали из аутологичной периферической крови 13; аутологичной сыворотки, в качестве дополнения к культуральной среде, была собрана из аутологичных афереза ​​цельной крови. Все пациенты получили подробную информацию о процедуре и подписали письменное информированное согласие. 1. Сбор пробы костного мозга Собирают костный мозг из бедренной кости костномозгового канала после тотального эндопротезирования тазобедренного сустава (для научных исследований). Если коротко, то во время хирургической подготовки костномозгового канала к чУз ортопедическую стебель, собирают кровь мозга , которая перетекает (около 10 – 15 мл, в зависимости от размера протеза) 15. ИЛИ Сбор кости аспирация костного мозга из гребня подвздошной кости под местной анестезией, после стандартной процедуры гематологические около 20 – 30 г заранее (для клинического применения) 16. Примечание: В обоих случаях гепарином шприцы (для предотвращения образования тромбов) должны быть использованы для восстановления костного мозга. 2. Получение аутологичной плазмы Сбор 20 мл периферической крови от пациента в приборке вакуумной крови, содержащих K3 ЭДТА (5,4 мг в 3 мл пробирки) и центрифуге при 2400 & bull; g в течение 15 мин. Аспирируйте компоненты плазмы в 15 мл трубки и не замерзает при -20 ° С до использования. 3. Приготовление аутологичной сыворотки Передача единицы плазмы в сумку переноса с использованием шип. Отсоедините заполненный мешок с помощью сварки и Weigч мешок для расчета объема плазмы (фиг.1А). Коагулирования аутологичной плазмы путем введения глюконата кальция 100 мг / мл при 10% вес / об через порт разъема (Рисунок 1В). После смешивания пакет, поместите его на 4 ° CO / N без встряхивания, чтобы облегчить образование тромбов. Центрифуга мешок в 4900 × г в течение 15 мин при комнатной температуре. Возьмите центрифугу ведро из центрифуги и осторожно снять мешок (следовать рекомендациям производителя по подготовке тромбоцитов лизата) (Рисунок 1C). Изолировать тромб прямо над зажимом, чтобы облегчить фильтрацию. Подключение комплекта фильтрации к сумке переноса использованием стержневой помещен в выходной порт комплекта фильтрации. Повесьте мешок и открыть синий зажим чтобы поток в сыворотке крови под действием силы тяжести. Не давите на фильтр, чтобы избежать передачи фибрина в мешок. После фильтрации, запечатать трубку и удалите мешок (следовать изготовлпринципы дитель для получения тромбоцитов лизата). Подключение по выделенной линии до конечной мешок и переноса сыворотки в 50 мл пробирки под лавкой ламинарного потока, чтобы избежать микробного загрязнения. Возьмите пробу с помощью шприца , чтобы проверить отсутствие фибриногена и провести испытание стерильности для аэробных и анаэробных бактериальных культур 17. Пометьте пробирки надлежащим образом и заморозить их при – 20 ° C до использования. 4. Подготовка расширения среды Подготовьте 500 мл полной среды распространения. Для Дульбекко модификации Дульбекко – низкий уровень глюкозы (DMEM-LG), добавьте 10% аутологичной сыворотки (полученного, как описано в разделе 3), 2 мМ глутамина, 1% раствор антибиотика и 1% противогрибкового раствора. Стерильный фильтр полная среда распространения. 5. Выделение hMSCs из костного мозга Переноса образца костного мозга (5 – 10 мл) из шприца в 50 мл коническую втбыть и разбавить его стерильным физиологическим раствором (соотношение 1: 4). Вихре 50 мл трубки в течение 30 лет, чтобы детализировать кластеры клеток. Подогреть градиент плотности (плотность 1,077 г / л, см таблицу материалов) до комнатной температуры перед использованием и слой разбавленного костный мозг мягко (для предотвращения смешивания обоих слоев) на градиент плотности путем добавления 20 мл образца до 15 мл плотности градиент для каждого 50 мл трубки (рисунок 2А). Центрифуга при 400 х г без тормоза при 25 ° С в течение 30 мин, затем собирают фракцию мононуклеарных на границе раздела жидкость-жидкость и перенести ее в новый 50 мл пробирку с использованием стерильного 5 мл пипетки. Промыть собранную фракцию мононуклеарных дважды с полной средой пролиферации и центрифугировать пробирки при 400 × г в течение 10 мин при 25 ° С для получения клеточных гранул. Жидкость над осадком сливают и осторожно ресуспендируют каждый осадок клеток в 5 мл полной среды распространения. Развести в соотношении 1: 100 для подсчета клеток. Граф клеток с помощью гемоцитометра после того, как 1: 1 разбавление окрашивания трипановым синим, чтобы оценить жизнеспособность клеток. 6. Культура hMSCs в присутствии аутологичной сыворотки Заполните два или более 75 см 2 культуры ткани (TC) колбах с 15 мл свежей полной среды распространения и не передавать их в культуре клеток инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO 2 до использования. семенной 0,3   – 0,5 х 10 6 клеток / см 2 (37,5 х 10 6 клеток / 15 мл свежей полной среды пролиферации) и инкубируют при температуре 37 ° С и 5% СО 2 в течение 48 ч. В то же время, начальное число 1 х 10 6 клеток в 25 см 2 ТК колбе с 5 мл свежей полной среды распространения для формирующего устройства колонии – фибробласта (CFU-F) анализа. Культура в течение 2-х недель (будет продолжено в разделе 12). Выбросьте среды и аккуратно мыть колбы с шага 6.2 с полной средой распространения РемуОве прилипших клеток и мусора. Добавить свежую среду в колбах и заменить половину его два раза в неделю, до 70 – 80% сплошности (первичной культуры, прохождение 0 (P0)) (рис 2В). Восстановление клеток с использованием конкретного свободного протеазы рекомбинантный животных (таблица материалов; используют 3 мл раствора на колбу в соответствии с рекомендациями производителя) и инкубируют при температуре 37 ° С и 5% СО 2 в течение 10 мин. Добавить 6 мл полной среды распространения на колбу и собирают в одну 50 мл трубки. Повторите шаг 5.6. Примечание: ВАЖНО: Использование этой протеазы вместо трипсина позволяет восстановление некоторых мезодермальных предшественниках клеток (ПДК) , присутствующих в культуре, которая трипсина устойчивостью. Для дальнейшего расширения, replate клеточной суспензии при 2000 – 3000 клеток / см 2 в новом 75 см 2 TC колб (P1) (рис 2С). С помощью аликвот клеток, чтобы оценить дифференциацией потенциалы ПКЦв направлении остеогенных, Adipogenic и хондрогенными родословных. Провести дифференциацию анализов в соответствии с рекомендациями производителя (рис 2D). Примечание: Различные методы окраски могут быть использованы для оценки мультилинейной дифференциации. 7. Подготовка Остеогенной среды с фармацевтических добавок Разбавленный раствор аскорбиновой кислоты (раствор 1А:. Аскорбиновая кислота 200 мг / мл (табл материалов) в соотношении 1:10 с DMEM-LG, чтобы получить 20 мг / мл раствора (раствор 1В, рабочий раствор) Фото аликвот растворов 1А и 1В при -20 ° С до использования. Ресуспендируют 1 г гидрокортизона в 10 мл стерильной воды (раствор 2А: гидрокортизон 100 мг / мл (см Таблицу материалов) разведенный раствор 2А в соотношении 1:. 1000 с DMEM-LG , чтобы получить 100 мкг раствора / мл (раствор 2B, работая раствор). Сток аликвоты растворов 2А и 2В при -20 ° С до использования. При использовании рсвежий остеогенной его восстановить среду следующим образом: добавить DMEM-LG с 10% аутологичной сыворотки, 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты и 0,4 мкг / мл гидрокортизона. Стерильный фильтр остеогенный среда. 8. Остеогенная Предварительная индукция и восстановление hMSCs Полностью удалить среду распространения и добавить остеогенных средних 96 ч до сбора клеток (то есть, 80 – 90% стечение обычно достигается в 7 г). Обеспечить дополнительный остеогенных замены среды за 24 ч до сбора клеток. Открепления клеток, как описано на стадии 6.5, и осторожно ресуспендируют осадок добавлением 2 мл полной среды пролиферации в трубке 50 мл. Примечание: Жизнеспособность клеток может быть снижена (около 10%) , в результате остеоиндукции. Клеточные агрегаты можно наблюдать. После подсчета, промыть клетки с полной средой пролиферации и центрифуге при 300 × г в течение 5 мин. Ресуспендируют осадок осторожно на 1 – 2 х 10 6 жизнеспособных клеток / 2мл аутогенной плазмы (см раздел 2) на 50 мл трубки. 9. Получение hMSC / фибринового сгустка конструктов Добавьте 150 мкл глюконата кальция в количестве 100 мг / мл в каждую пробирку по 50 мл полученного на стадии 8.3. и клетки вновь суспендируют при осторожном встряхивании. Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 15 – 30 мин , чтобы получить hMSC / фибринового сгустка конструкции (рис 3 , а ). Подготовьте фибринового сгустка конструкцию без клеток, которые будут использоваться в качестве контроля. Примечание: ВАЖНО: Это рекомендуется подготовить этот контроль сгустка по крайней мере , 2 ч до анализа жизнеспособности клеток, так как она занимает 30 минут или более сшивать. 10. Жизнеспособность клеток Анализ Удалите жидкость из 50 мл пробирки и добавляют 1 мл полной среды пролиферации , содержащей 10% v / v жизнеспособность клеток реагента (AB, см таблицу материалов), в соответствии с рекомендациями производителя. Выдержите тысе пробирки при температуре 37 ° С и 5% СО 2 в течение 3 часов. Измеряют поглощение при 570 нм с эталонной длине волны 600 нм (АВ в момент времени 0, t0). Удалите супернатант и добавляют 2 мл свежей полной среды распространения. Инкубировать при 37 ° C, 5% CO 2 O / N. На следующий день (AB в момент времени 24 ч, T24), повторите шаги с 10.1 до 10.3 (Рисунок 3B). 11. Гистологическое Оценка Жизнеспособность клеток и отложение кальция внутри фибринового сгустка конструктов Закрепить / фибринового сгустка конструкции hMSC в 4% вес / об нейтральном буферном растворе формалина O / N при 4 ° С. Вымойте 4x в D-PBS в течение 15 мин и хранят в 70% этаноле. Обезвоживают образцы при температуре 40 ° С в серии градуированных этанола: 80% один раз в течение 30 мин, 95% в два раза в течение 45 мин и 3 х 100% в течение 1 ч. Уточнить дважды в ксилоле в течение 45 мин при 40 ° С. Промыть образцов в жидком парафине при 60 & deg; С в течение 2 ч и вставлять их. Вырезать блок парафина с помощью микротома и смонтировать тон секции (5 мкм) на стеклах. Пятно депарафинировали секции , используя стандартный метод гематоксилином и эозином (H & E) (рис 3C). Выполните фон Косса окрашивания путем обработки участков с добавлением 1% нитрата серебра в течение 15 мин, 0,5% Пирогаллол в течение 2 мин, 5% раствором тиосульфата натрия в течение 2 мин. Проводят контрастное участки с 0,1% ядерного быстрого красного, разбавленного в растворе, содержащем 5 г сульфата алюминия в течение 5 мин и ополаскивают их в водопроводной воде в течение 5 мин. Установите секции с монтажным агентом. Оценка минерального осаждения в виде черных гранул под световым микроскопом (400X увеличение) (Рисунок 3D). 12. КОЕ-F Анализ Промыть колбу 25 см 2 (со стадии 6.3.) С D-PBS. Пятно с использованием стандартного метода, Май-Грюнвальд / Giemsa. Визуально количественно число hMSC, забив отдельных колоний (Рисунок 4) под световым микроскопом. Примечание: Есликостный мозг принимается на шаге 1.2. а секции 2 – 9 выполняются в надлежащей производственной практики (GMP) с необходимым одобрения регулирующих органов, в hMSC / фибринового сгустка конструкции могут быть имплантированы для ортопедических приложений.

Representative Results

Получение аутологичной сыворотки Коагуляция, осуществляется путем добавления кальция глюконат в передаточное мешок, позволяет извлекать аутологичной сыворотки в больших количествах, как это требуется для культуры hMSC. В самом деле, с этой техникой, можно достичь до 200 мл сыворотки (рисунок 1). HMSC изоляция, культура и дифференциации с использованием аутологичной сыворотки Костные мононуклеарные клетки костного мозга выделяют с использованием градиента плотности, что приводит к промежуточному слою кольцевого (фиг.2А). Путем покрывать эти клетки и удаления прилипших них с промывкой, то можно изолировать hMSCs (рис 2б). При аутологичных условиях культивирования, подмножество клеток, называемых ПДКп, обнаруживаются при P0 и в процентах до тO 10%, в зависимости от вариабельности пациентов (Фигура 2В). ПДКп все еще присутствуют после replating (т.е. P1) , если протеаза используется для клеточного пассирования (фиг.2с). hMSCs выделяют и культивируют в аутологической обстановке поддерживать их способность дифференцироваться в направлении трех хорошо известных мезодермальных клонов (остеогенной, липогенный и хондрогенными). Дифференцирования анализы проводили для сравнения идентичности населения hMSC с результатами, полученными с использованием стандартных (nonautologous) условий культивирования. Как были выбраны функциональные анализы для этого протокола, фон Косса окрашивания, четырехокиси осми окрашивания и Альциановый Синей окрашивания при рН 1 вместо предложенным производителем дифференцировки (таблица материалов) (рис 2D). Подготовка, жизнеспособность и гистологическое характеристика MSC / фибринового сгустка конструкций <p class="jove_content" fo:keep-together.within-страница = "1"> В hMSCs диспергируют в плазме, который сшивают глюконата кальция в 50 мл трубки, что приводит к образованию желе диска , окруженного его надосадочной жидкости (рис 3 , а ). Внутри этих плазменных сгустков, что hMSCs жизнеспособны, о чем свидетельствует изменение цвета Т24 красителя жизнеспособность клеток от синего (управления без клеток) до розового (cellularized тромб) (рис 3B). Жизнеспособность клеток внутри сгустка подтверждается с помощью окрашивания H & E, показывая хорошо сохранившийся морфологии клеток (рис 3C). Кроме того, минимальный остеоиндукция как раз перед второй урожай клеток приводит к предварительным депонированием кальция Стимулируемой hMSCs (рис 3D). Колониеобразующих Unit Присутствие hMSC колоний через 2 недели в культуре показано с помощью анализа КОЕ-F (рисунок 4). <p clas s = "jove_step" ВОК: Keep-together.within-страницу = "1"> Применение MSC / фибринового сгустка построить в костном несращения HMSC / фибринового сгустка конструкции , полученные , как описано в этом методе (этап 1.1) были успешно применены для лечения тяжелых верхних конечностей несращения в 8 сострадательных случаях 13. Долгосрочный (максимум 7,6 мес) оценки подтвердили успешные клинические и функциональные результаты для всех пациентов, без признаков разрастания ткани или образования опухоли. Рисунок 1. Получение аутологичной сыворотки. (А) Устройство плазма переносится в сумке переноса с использованием шип; (В) Плазма коагулируют путем введения кальция глюконат через разъем порта; (C) гематоэнцефалический мешок центрифуга используется для отделения сыворотки./files/ftp_upload/54845/54845fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 2. hMSC Изоляция, культуры и дифференцировка с использованием аутологичной сыворотки. (A) мононуклеарных клеток слой (в окне синей линии) , полученные после того, как костный мозг центрифугирование с градиентом плотности; (В) культуры клеток , как представляется , в P1; (С) клеточной культуре , как это кажется на P0 (первичная культура); (B – C) Стрелки показывают наличие MPCs в культуре MSC. Шкала бар составляет 100 мкм; (D) Гистохимические результаты мультилинейной дифференциации анализов. Остеогенная дифференциация оценивается с использованием фон Косса окрашивания для нанесения минеральной матрицы в черном, адипогенной дифференциации проявляется наличием жировых вакуолей, окрашенных в черный цвет с помощью осмия tetroxiде, и хондрогенный дифференциация отображается наличием гликозаминогликанов, которые окрашивают в голубой цвет по альциановым голубым окрашиванием при рН 1. Шкала бар составляет 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 3. Подготовка, Жизнеспособность и гистологические Характеристика MSC / фибринового сгустка конструктов. (A) / фибринового сгустка hMSC построить , как он появляется после сшивания; (B) Результаты AB – анализ: MSCs являются жизнеспособными внутри фибринового сгустка, о чем свидетельствует изменение цвета жизнеспособность клеток красителя (T24), от синего (контроль без клеток, справа) до розового (cellularized тромб, на оставил). (C – D) Гистохимические результаты hMSC / фибринового сгустка конструкций. Шкала бар50 мкм. (С) гематоксилином и эозином окрашивания показывая жизнеспособных клеток , внедренных в матрицу фибринового; (D) Минеральная матрица осаждения окрашенных в черный цвет на фон Косса окрашивания, что подтверждает первоначальную остеогенез. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 4. CFU-F анализа. Изображение колбе культивировали с hMSCs окрашивали методом May-Grunwald / Гимза. Увеличиваемую область представляет собой светло-микрофотография, показывающая морфологии колонии hMSC. Шкала бар составляет 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= "1"> Рисунок 5. Применение hMSC / фибринового сгустка Построить в костном несращением. (A) рентгенография верхней конечности пациента , пострадавших от псевдоартрозов; (B) hMSC / фибринового сгустка конструкцию непосредственно перед имплантацией; (C) Хирургический применение hMSC / фибринового сгустка конструкции; (D) рентгенография верхней конечности одного и того же пациента через 5 лет. Эта цифра переиздана из Джианнотти С. и др. с минимальными изменениями 13. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Критические шаги этого протокола касаются использования взрослого сыворотки человека и протеазы, которые позволяют получить BIOSAFE hMSC терапию. В частности, взрослого человека в сыворотке крови позволяет изоляции и технического обслуживания, в то время как протеаза обеспечивает урожай, ПДК. Эти незрелые клетки, присутствующие в костном мозге, которые могут привести к новым hMSCs, обеспечивая тем самым резервуар жизнеспособных hMSCs по времени культивирования. Не все ПДКп можно собирать, так как увеличение времени экспозиции к активности протеаз отрицательно сказывается на жизнеспособности hMSC. По этой причине инкубации протеазы в 10 мин был выбран в качестве оптимального компромисса между восстановлением и MPCs жизнеспособности hMSCs. Другим важным шагом является время osteodifferentiation. Действительно, обширная в пробирке osteodifferentiation бы значительно снизить жизнеспособность клеток, влияя таким образом на окончательное формирование костной ткани в естественных условиях. Последний важный шаг заключается в том, пользующимися из аутологичных биорезорбируемого эшафот, whicч получают путем встраивания клеток (hMSCs и MPCs) в виде геля фибрина из плазмы свертываемости.

Ключевым шагом для повышения урожайности MPCs является семян мононуклеарных клеток при более высокой концентрации. С помощью процедуры Аферезная для получения плазмы и обработки его глюконата кальция позволяет достичь аутологичной сыворотки в больших количествах. Было установлено, что сыворотка крови человека в качестве среды добавка сопоставима с фетальной бычьей сыворотки (FBS) в hMSC культурах. Тем не менее, по нашему опыту, полная среда с добавлением FBS способствует более быстрому старению, чем у взрослого человека сыворотки. Важным шагом является то, что введение минимальной остеоиндукция к hMSCs. На самом деле, это лечение приводит клетки легко дифференцировать к остеогенной линии, таким образом , быть полезным , чтобы избежать дальнейшей трансформации клеток в живом организме . Для того, чтобы поддерживать хорошую жизнеспособность минимально osteoinduced hMSCs, рекомендуется тщательно соблюдать рекомендации, описанные в шагах 6.5.d 8.2., в том числе обработка, центрифугирование и средние суммы, которые будут добавлены. Если процедура афереза ​​недоступна, это все еще возможно осуществить этот протокол, выполняя несколько кровь привлекает к пациенту или, в качестве альтернативы, при покупке Pooled AB сывороток. Очевидно, что для того, чтобы довести этот протокол от скамьи к постели больного, обязательно иметь фабрики клеток GMP, или их эквиваленты, освобождена.

Ограничения к применению этой методики касаются анемией, гематологического-онкология и ортопедических больных, пострадавших от остеомиелита., Drawing большое количество крови от пациентов с анемией, следует избегать. В онкологических больных, качество образцов клеток зависит от химиотерапии, в то время как у пациентов, остеомиелит инфекция может повлиять на конечный результат. Во всех случаях, в которых аутологичной сыворотки является недостаточным или неподходящим, объединяли мужчины AB сывороток представляют собой хорошую альтернативу.

Использование клеток / фибрина CLOт конструкции для возможных клинических применений важно , чтобы выпустить полностью аутологичных клеточную терапию, которая может быть простой в обращении и плесени во время операции, что приводит к отличным результатам для лечения костей , не являющиеся союзам 13. Для клинических целей hMSCs обычно вводят с помощью двух основных процедур: минимальные манипуляции и обширные манипуляции 9. Для преодоления проблем , связанных с обширной экс естественных условиях культуры, такие как аномалии в морфологии и размера 18 клеток, мы провели некоторое время экс расширения естественных клеток и костно-дифференцировки (только 4 г).

Протокол Зенона бесплатно описанный в этой статье, наряду с короткими расширения клеток и osteodifferentiation раз продемонстрировал свою актуальность в клиниках для того , чтобы получить быстрое производство костной ткани в естественных условиях, без признаков разрастания ткани и трансформации, подтвердив тем самым его эффективность и длительный -term безопасности в ремонте кости (рисунок 5) </stroнг> 13.

Методология , представленная в настоящем докладе , направлен на демонстрацию эффективности и безопасности hMSC в пробирке расширения в аутологичных условиях для возможного использования в ортопедической хирургии. Этот протокол использует hMSCs, выделенные из костного мозга и культивировали в среде, дополненной аутологичной сыворотки и заливали в аутологичной фибринового сгустка, обеспечивая тем самым полностью аутологичной клеточной терапии. Два раза остеогенной индукции, как раз перед вторым отрядом, улучшает способность hMSC дифференцироваться в остеобласты. В результате, этот способ особенно подходит для применения в костных дефектов, так как оно не ограничивается псевдоартрозов. Возможные будущие приложения могут включать в себя Talus кисту и управление потерей костной массы.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was funded by the Tuscany Region (grant number 539999_2014_Petrini_CUCCS). The authors would like to thank Prof. S. Berrettini for authorizing the use of the Otolab laboratory and instruments, and the surgery staff from the Orthopedic Clinic II of the University of Pisa, for the fundamental cooperation in sample harvesting. The support provided by Dr. F. Scatena is gratefully acknowledged. Finally, many thanks are due to Mr. J.G. De La Ossa for his precious contribution to histologic processing.

Materials

Triple Select (1x) GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES 12563-029 cell culture
Trypan blue stain  GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES 15250061 cell culture
DMEM-LG, no glut, no phenol red GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES 11880-028  cell culture
Glutamax (100X) Gibco, Life Technologies 35050038 cell culture
Penicillin Streptomycin sol. Gibco, Life Technologies 15140122 cell culture
Alamar Blue (AB) Gibco, Life Technologies DAL1025 proliferation/viability assay
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-14440-02 cell culture
D-PBS  Gibco, Life Technologies 14190-094 cell culture
StemMACS AdipoDiff Media Miltenyi Biotech 130-091-677 cell culture
StemMACS ChondroDiff Media Miltenyi Biotech 130-091-679 cell culture
hMSC Osteogenicdiff BulletKit Euroclone  LOPT3002 cell culture
Vitamin C (ascorbic acid) Bayer ATC Code: A11GA01 Pharmaceutical grade drug
Flebocortid Richter (hydrocortisone) Aventis Pharma ATC Code: H02AB09 Pharmaceutical grade drug
Victor X3, reader PerkinElmer 2030 multilabel reader proliferation/viability assay
Silver nitrate Sigma Aldrich 209139 histological assay
Pyrogallol Sigma Aldrich 16040 histological assay
Sodium Thiosulphate Sigma Aldrich S8503 histological assay
Histoplast LP Thermo Scientific 8332 histological assay
Methanol Sigma Aldrich 32213 histological assay
Ethanol Sigma Aldrich 2860 histological assay
Nuclear fast red Sigma Aldrich 60700 histological assay
Formalin Bio-optica 05-K01009-X40 histological assay
Eosin B Sigma Aldrich 45260 histological assay
DPX Sigma Aldrich 6522 histological assay
Haematoxylin Sigma Aldrich H3136 histological assay
Aluminium Sulphate Sigma Aldrich 202614 histological assay
Xylol Sigma Aldrich 534056 histological assay
Microtome Leika histological assay
May Grunwald Sigma Aldrich MG1L-1L histological assay
Giemsa Sigma Aldrich 32884-250ML histological assay
Transfer bag Biomérieux BC0300031 cell culture
Filtration kit Macopharma BC0800010 cell culture
Calcium Gluconate Galenica Senese Pharmaceutical grade drug
Bact Alert Biomérieux 259790 anaerobic  microbiological assay
Bact Alert Biomérieux 259789 aerobic  microbiological assay
Steryle Luer-Lok Syringe 50 ml BD Plastipak 300865 cell processing
Heraeus Cryofuge 6000i Thermo Scientific blood bag centrifuging
SL16R Centrifuge Thermo Scientific blood tube centrifuging

References

  1. Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7, 393-395 (2005).
  2. Kassem, M., Abdallah, B. M. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: biological characteristics and potential role in therapy of degenerative diseases. Cell Tissue Res. 331, 157-163 (2008).
  3. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
  4. Bonfield, T. L., Nolan Koloze, M. T., Lennon, D. P., Caplan, A. I. Defining human mesenchymal stem cells efficacy in vivo. J Inflamm. (Lond). 25 (7), 51 (2010).
  5. Pneumaticos, S. G., Triantafyllopoulos, G. K., Chatziioannou, S., Basdra, E. K., Papavassiliou, A. G. Biomolecular strategies of bone augmentation in spinal surgery. Trends Mol. Med. 17 (4), 215-222 (2011).
  6. Amhed, T. A. E., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: A versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Engineering Part B. 14 (2), 199-215 (2008).
  7. Silbertein, L. E., Williams, L. J., Huglett, M. A., Magee, D. A., Weisman, R. A. An autologous fibrinogen-based adhesive for use in oncologic surgery. Transfusion. 28 (4), 319-321 (1988).
  8. Jockenhoevel, S., et al. Fibrin gel advantages of a new scaffold in cardiovascular tissue engineering. Eur. J. Cardiothorac Surg. 19 (4), 424-430 (2001).
  9. Veronesi, F., et al. Clinical use of bone marrow, bone marrow concentrate, and expanded bone marrow mesenchymal stem cells in cartilage disease. Stem Cells Dev. 22 (2), 181-192 (2013).
  10. Petrini, M., et al. Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow. Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).
  11. Trombi, L., et al. Selective culture of mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).
  12. Trombi, L., et al. Human autologous plasma-derived clot as a biological scaffold for mesenchymal stem cells in treatment of orthopedic healing. J. Orthop. Res. 26 (2), 176-183 (2008).
  13. Giannotti, S., et al. Use of autologous human mesenchymal stromal cell/fibrin clot constructs in upper limb non-unions: long term assessment. PlosOne. 8 (8), 73893 (2013).
  14. Castano-Izquierdo, H., et al. Pre-culture period of mesenchymal stem cells in osteogenic media influences their in vivo bone forming potential. J. Biomed. Mater. Res. A. 82 (1), 129-138 (2007).
  15. Malkani, A. L., Fitzgerald, R. H., Kaufer, H. . Orthopaedics. , (2002).
  16. Lee, S. H., et al. ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. Int J Lab Hematol. 30 (5), 349-364 (2008).
  17. Bugno, A., et al. Application of the BacT/ALERTR 3D system for sterility testingof injectable products. Braz J Microbiol. 46 (3), 743-747 (2015).
  18. Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cells in vitro. BMC Cell Biology. 7, 14 (2006).

Play Video

Cite This Article
Trombi, L., Danti, S., Savelli, S., Moscato, S., D’Alessandro, D., Ricci, C., Giannotti, S., Petrini, M. Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications. J. Vis. Exp. (118), e54845, doi:10.3791/54845 (2016).

View Video