Культивирование человеческих клеток мезенхимальных стромальных (hMSCs) с аутологичной сыворотки, снижает риск отторжения от ксеногенного материала и других негативных последствий. Она также позволяет для восстановления подмножества мезодермальных предшественниках, которые могут доставить свежие hMSCs. Встраивание hMSCs в аутологичных фибринового сгустка обеспечивает простой и эффективной хирургической имплантации.
Человеческие клетки мезенхимальных стромальных (hMSCs) культивировали в пробирке с различными средами. Ограничения на их использование в клинических условиях, однако, в основном зависит от потенциальных биологически опасных и воспаление рисков, оказываемого ксеногенных питательными веществами для их культуры. Человеческие производные или рекомбинантные материалы являются первыми кандидатами выбор, чтобы уменьшить эти реакции. Таким образом, культура добавки и материалы аутологичных происхождения представляют лучшие питательные вещества и безопасные продукты.
Здесь мы опишем новый протокол для изоляции и культуры hMSCs костного мозга в аутологичных условиях, а именно – пациента происхождения сыворотки в качестве дополнения для культуральной среды и фибрина в качестве каркаса для введения hMSC. В самом деле, hMSC / фибринового сгустка конструкции могут быть чрезвычайно полезны для нескольких клинических применений. В частности, мы ориентируемся на их использование в ортопедической хирургии, где тромб фибрина происходит от собственной крови донора разрешеноэффективной доставки клеток и питательных веществ / отходов обмены. Для обеспечения оптимальных условий безопасности, это крайне важно, чтобы избежать риска трансформации hMSC и разрастание ткани. По этим причинам подход , описанный в этой статье также указывает на минимально ех естественных условиях hMSC расширения, для уменьшения клеточного старения и морфологические изменения, а также краткосрочный костно-дифференциацию перед имплантацией, чтобы побудить остеогенной спецификации клонов, тем самым снижая риск последующего неконтролируемого пролиферации.
Человек мезенхимальных стромальных клеток (hMSCs) представляют собой один из лучших источников клеток для использования в тканевой инженерии для содействия остеогенез 1,2. Они легко выделены из костного мозга и других тканей взрослого, и выражают типичные поверхностные маркеры , такие как CD90, CD105, CD73 1. Более того, они могут дифференцироваться в несколько типов клеток, таких как остеобласты, хондроциты и адипоциты 3. Их терапевтический эффект объясняется их регенеративных и трофических свойств 4. hMSCs можно было бы использовать в ортопедической хирургии, а также в других регенеративных клинических применений. Их предпочтительно в сочетании с подмостей, чтобы улучшить клинический исход 5.
По сравнению с другими материалами, гель – фибрин показывает интересные свойства , такие как липкостью, резорбции и эффективной транспортировки питательных веществ, что делает его чрезвычайно полезным для различных тканевой инженерии 6,7.
<p cдеваха = "jove_content"> Основной задачей в переводе инженерный подход ткани в клинических применений является получение полностью биосовместимого и BIOSAFE эшафот и Xeno свободной культуральной среде, которая позволяет избежать любой инфекционный или реактивную эффект.В нашем методе фибринового геля, полученного из собственной крови пациента, и аутологичной сыворотки, для культивирования в пробирке hMSCs, были использованы в качестве возможного терапевтического раствора в ортопедической области 8.
Для клинических целей hMSCs, как правило , управляются с помощью двух основных процедур: (I) процедуры "одностадийного" (т.е. минимальное манипуляции), что позволяет автоматическое пересадка костного мозга, либо полностью или концентрированные (т.е. мононуклеары), во время операции; и (II) , процедура "двухстадийный" (то есть, обширные манипуляции), который основан на экс виво расширения hMSCs , чтобы увеличить их урожайность до имплантации, и требует GMP 9 объектов. Интересно отметить , что культивированием клеток с взрослого человека сыворотки вместо коровьей сыворотки теленка позволяет извлекать вместе с hMSCs, подмножества клеток (1 – 10% в мононуклеарных культурах) , называемые Мезодерма клетки – предшественники (ПДК), которые способны дифференцироваться в пробирке в пресную hMSCs 10,11. Таким образом, hMPCs может играть существенную роль в восстановительном процессе, по сравнению с только 12,13 hMSCs. И, наконец, краткосрочные костно-индукционная толкает hMSCs , чтобы начать их дифференцировки в остеогенной линии без потери их пролиферативный потенциал и жизнеспособность 12. Эти результаты подтверждают предыдущие исследования, которые сообщили усиливается в естественных условиях формирования костной ткани с помощью hMSCs, а затем с помощью предкультурой в остеогенной среде 14. К тому же , аутологичной сгустка плазмы , как помост для доставки клеток можно легко манипулировать с помощью хирурга и формованные , чтобы соответствовать форме кости полости 13.
Therefore, этот метод может быть очень полезным для тех исследователей и врачей, которые направлены на перевод их hMSC терапии на основе от скамьи к постели больного в ортопедической практике.
Критические шаги этого протокола касаются использования взрослого сыворотки человека и протеазы, которые позволяют получить BIOSAFE hMSC терапию. В частности, взрослого человека в сыворотке крови позволяет изоляции и технического обслуживания, в то время как протеаза обеспечивает урожай, ПДК. Эти незрелые клетки, присутствующие в костном мозге, которые могут привести к новым hMSCs, обеспечивая тем самым резервуар жизнеспособных hMSCs по времени культивирования. Не все ПДКп можно собирать, так как увеличение времени экспозиции к активности протеаз отрицательно сказывается на жизнеспособности hMSC. По этой причине инкубации протеазы в 10 мин был выбран в качестве оптимального компромисса между восстановлением и MPCs жизнеспособности hMSCs. Другим важным шагом является время osteodifferentiation. Действительно, обширная в пробирке osteodifferentiation бы значительно снизить жизнеспособность клеток, влияя таким образом на окончательное формирование костной ткани в естественных условиях. Последний важный шаг заключается в том, пользующимися из аутологичных биорезорбируемого эшафот, whicч получают путем встраивания клеток (hMSCs и MPCs) в виде геля фибрина из плазмы свертываемости.
Ключевым шагом для повышения урожайности MPCs является семян мононуклеарных клеток при более высокой концентрации. С помощью процедуры Аферезная для получения плазмы и обработки его глюконата кальция позволяет достичь аутологичной сыворотки в больших количествах. Было установлено, что сыворотка крови человека в качестве среды добавка сопоставима с фетальной бычьей сыворотки (FBS) в hMSC культурах. Тем не менее, по нашему опыту, полная среда с добавлением FBS способствует более быстрому старению, чем у взрослого человека сыворотки. Важным шагом является то, что введение минимальной остеоиндукция к hMSCs. На самом деле, это лечение приводит клетки легко дифференцировать к остеогенной линии, таким образом , быть полезным , чтобы избежать дальнейшей трансформации клеток в живом организме . Для того, чтобы поддерживать хорошую жизнеспособность минимально osteoinduced hMSCs, рекомендуется тщательно соблюдать рекомендации, описанные в шагах 6.5.d 8.2., в том числе обработка, центрифугирование и средние суммы, которые будут добавлены. Если процедура афереза недоступна, это все еще возможно осуществить этот протокол, выполняя несколько кровь привлекает к пациенту или, в качестве альтернативы, при покупке Pooled AB сывороток. Очевидно, что для того, чтобы довести этот протокол от скамьи к постели больного, обязательно иметь фабрики клеток GMP, или их эквиваленты, освобождена.
Ограничения к применению этой методики касаются анемией, гематологического-онкология и ортопедических больных, пострадавших от остеомиелита., Drawing большое количество крови от пациентов с анемией, следует избегать. В онкологических больных, качество образцов клеток зависит от химиотерапии, в то время как у пациентов, остеомиелит инфекция может повлиять на конечный результат. Во всех случаях, в которых аутологичной сыворотки является недостаточным или неподходящим, объединяли мужчины AB сывороток представляют собой хорошую альтернативу.
Использование клеток / фибрина CLOт конструкции для возможных клинических применений важно , чтобы выпустить полностью аутологичных клеточную терапию, которая может быть простой в обращении и плесени во время операции, что приводит к отличным результатам для лечения костей , не являющиеся союзам 13. Для клинических целей hMSCs обычно вводят с помощью двух основных процедур: минимальные манипуляции и обширные манипуляции 9. Для преодоления проблем , связанных с обширной экс естественных условиях культуры, такие как аномалии в морфологии и размера 18 клеток, мы провели некоторое время экс расширения естественных клеток и костно-дифференцировки (только 4 г).
Протокол Зенона бесплатно описанный в этой статье, наряду с короткими расширения клеток и osteodifferentiation раз продемонстрировал свою актуальность в клиниках для того , чтобы получить быстрое производство костной ткани в естественных условиях, без признаков разрастания ткани и трансформации, подтвердив тем самым его эффективность и длительный -term безопасности в ремонте кости (рисунок 5) </stroнг> 13.
Методология , представленная в настоящем докладе , направлен на демонстрацию эффективности и безопасности hMSC в пробирке расширения в аутологичных условиях для возможного использования в ортопедической хирургии. Этот протокол использует hMSCs, выделенные из костного мозга и культивировали в среде, дополненной аутологичной сыворотки и заливали в аутологичной фибринового сгустка, обеспечивая тем самым полностью аутологичной клеточной терапии. Два раза остеогенной индукции, как раз перед вторым отрядом, улучшает способность hMSC дифференцироваться в остеобласты. В результате, этот способ особенно подходит для применения в костных дефектов, так как оно не ограничивается псевдоартрозов. Возможные будущие приложения могут включать в себя Talus кисту и управление потерей костной массы.
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by the Tuscany Region (grant number 539999_2014_Petrini_CUCCS). The authors would like to thank Prof. S. Berrettini for authorizing the use of the Otolab laboratory and instruments, and the surgery staff from the Orthopedic Clinic II of the University of Pisa, for the fundamental cooperation in sample harvesting. The support provided by Dr. F. Scatena is gratefully acknowledged. Finally, many thanks are due to Mr. J.G. De La Ossa for his precious contribution to histologic processing.
Triple Select (1x) | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 12563-029 | cell culture |
Trypan blue stain | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
DMEM-LG, no glut, no phenol red | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 11880-028 | cell culture |
Glutamax (100X) | Gibco, Life Technologies | 35050038 | cell culture |
Penicillin Streptomycin sol. | Gibco, Life Technologies | 15140122 | cell culture |
Alamar Blue (AB) | Gibco, Life Technologies | DAL1025 | proliferation/viability assay |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-14440-02 | cell culture |
D-PBS | Gibco, Life Technologies | 14190-094 | cell culture |
StemMACS AdipoDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-677 | cell culture |
StemMACS ChondroDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-679 | cell culture |
hMSC Osteogenicdiff BulletKit | Euroclone | LOPT3002 | cell culture |
Vitamin C (ascorbic acid) | Bayer | ATC Code: A11GA01 | Pharmaceutical grade drug |
Flebocortid Richter (hydrocortisone) | Aventis Pharma | ATC Code: H02AB09 | Pharmaceutical grade drug |
Victor X3, reader | PerkinElmer | 2030 multilabel reader | proliferation/viability assay |
Silver nitrate | Sigma Aldrich | 209139 | histological assay |
Pyrogallol | Sigma Aldrich | 16040 | histological assay |
Sodium Thiosulphate | Sigma Aldrich | S8503 | histological assay |
Histoplast LP | Thermo Scientific | 8332 | histological assay |
Methanol | Sigma Aldrich | 32213 | histological assay |
Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | histological assay |
Nuclear fast red | Sigma Aldrich | 60700 | histological assay |
Formalin | Bio-optica | 05-K01009-X40 | histological assay |
Eosin B | Sigma Aldrich | 45260 | histological assay |
DPX | Sigma Aldrich | 6522 | histological assay |
Haematoxylin | Sigma Aldrich | H3136 | histological assay |
Aluminium Sulphate | Sigma Aldrich | 202614 | histological assay |
Xylol | Sigma Aldrich | 534056 | histological assay |
Microtome | Leika | histological assay | |
May Grunwald | Sigma Aldrich | MG1L-1L | histological assay |
Giemsa | Sigma Aldrich | 32884-250ML | histological assay |
Transfer bag | Biomérieux | BC0300031 | cell culture |
Filtration kit | Macopharma | BC0800010 | cell culture |
Calcium Gluconate | Galenica Senese | Pharmaceutical grade drug | |
Bact Alert | Biomérieux | 259790 anaerobic | microbiological assay |
Bact Alert | Biomérieux | 259789 aerobic | microbiological assay |
Steryle Luer-Lok Syringe 50 ml | BD Plastipak | 300865 | cell processing |
Heraeus Cryofuge 6000i | Thermo Scientific | blood bag centrifuging | |
SL16R Centrifuge | Thermo Scientific | blood tube centrifuging |