Mesenchymale Stromazellen Zellkultur und Lieferung in Autologe Bedingungen: Ein intelligenter Ansatz für orthopädische Anwendungen

Das vorliegende Protokoll wurde im Einklang mit der World Medical Association Deklaration von Helsinki über die ethischen Grundsätze in der Forschung am Menschen entwickelt. Es wurde von der Ethikkommission der Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana genehmigt. HINWEIS: Das Knochenmark von Patienten erhalten wurde unterziehen Routine insgesamt Hüftoperation (nach 1.1 zu Schritt) 15; Plasma für das Gerinnsel Präparat wurde aus autologem peripheren Blut 13 erhalten wird ; autologem Serum, als Ergänzung für das Kulturmedium wurde von autologem Vollblut-Apherese gesammelt. Alle Patienten erhielten eine detaillierte Information über das Verfahren und unterzeichneten eine schriftliche Einverständniserklärung. 1. Sammlung der Knochenmarkprobe Sammeln Knochenmark aus dem Oberschenkelmarkkanal nach einer Hüft-TEP Operation (für Forschungsstudien). Kurz gesagt, während des chirurgischen Vorbereitung des Markkanals zu hOuse die Prothesenschafts, sammeln das Mark Blut , das überläuft (etwa 10 bis 15 ml, in Abhängigkeit von der Prothesengröße) 15. ODER Sammeln Sie Knochenmarkaspirat aus dem Beckenkamm unter örtlicher Betäubung, nach Standard hämatologischen Verfahren etwa 20 – 30 d im Voraus (für klinische Anwendungen) 16. HINWEIS: In beiden Fällen heparinisierte Spritzen (Gerinnselbildung zu vermeiden) müssen für Knochenmarkwiederherstellung verwendet werden. 2. Herstellung von autologem Plasma Sammle 20 ml peripheres Blut von dem Patienten in Vakuum-Blutsammelröhrchen mit K3 EDTA (5,4 mg in 3 ml Röhrchen) und Zentrifugation bei 2.400 × g für 15 min. Aspirieren der Plasmakomponente in einem 15 ml-Röhrchen und gefrier bei -20 ° C bis zur Verwendung. 3. Herstellung der Autologe Serum Übertragen Sie die Einheit von Plasma in einen Transferbeutel ein Dorn verwendet wird. Ziehen Sie den gefüllten Beutel durch Schweißen und weigh der Beutel das Volumen an Plasma (1A) zu berechnen. Koagulieren der autologem Plasma von Calciumgluconat 100 Injizieren mg / ml bei 10% w / v durch den Anschluss – Stecker (1B). Nach dem Mischbeutel, legen Sie sie bei 4 ° CO / N ohne Schütteln Gerinnselbildung zu erleichtern. Zentrifugieren Sie den Beutel bei 4.900 × g für 15 min bei RT. Nehmen Sie die Zentrifugenbecher aus der Zentrifuge und entfernen Sie den Beutel vorsichtig (folgen Sie den Richtlinien des Herstellers für die Herstellung von Blutplättchenlysat) (1C). Isolieren Sie das Gerinnsel knapp oberhalb der Klemme Filtration zu erleichtern. Schließen Sie das Filtrations-Kit an den Transferbeutel mit einem Dorn platziert in die Austrittsöffnung des Filtrations-Kit. Hängen Sie die Tasche und öffnen Sie die blaue Klemme des Serums Fluss durch die Schwerkraft zu lassen. Üben Sie keinen Druck auf den Filter anwenden Übertragung von Fibrin in die Tasche zu vermeiden. den Schlauch Nach der Filtration versiegeln und den Beutel (folgen Sie dem Herstel entfernenlers Richtlinien zur Herstellung von Blutplättchenlysat). Schließen Sie eine Standleitung zum Endsacks und Transfer Serum in 50 ml-Röhrchen unter einer Laminar-Flow-Bank mikrobielle Kontamination zu vermeiden. Nehmen Sie eine Probe mit einer Spritze , die die Abwesenheit von Fibrinogen zu testen und eine Sterilitätstest für aerobe und anaerobe Bakterienkulturen 17 durchführen. Beschriften Sie die Rohre in geeigneter Weise und frieren sie bei – 20 ° C bis zur Verwendung. 4. Vorbereitung der Expansion Medium Bereiten Sie 500 ml vollständigen Proliferationsmedium. Um Dulbecco modifiziertem Eagle Medium – Low Glucose (DMEM-LG), mit 10% autologem Serum (erhalten wie in Abschnitt 3 beschrieben), 2 mM Glutamin, 1% Antibiotika-Lösung und 1% Antimykotika-Lösung. Sterile-Filter die vollständige Proliferationsmedium. 5. Isolierung von hMSCs aus dem Knochenmark Übertragung der Knochenmarkprobe (von 5 bis 10 ml) aus der Spritze in ein konisches 50 ml-tuund verdünnen Sie es mit steriler Kochsalzlösung (Verhältnis 1: 4). Vortex, um die 50-ml-Röhrchen für 30 s die Zellcluster aufzuschlüsseln. Erwärmen Sie die Dichte – Gradienten (Dichte 1,077 g / l; siehe Tabelle der Materialien) auf RT vor dem Gebrauch und der Schicht des verdünnten Knochenmark sanft (zu verhindern , dass beide Schichten Mischen) auf den Dichtegradienten durch Zugabe von 20 ml der Probe zu 15 ml Dichte Gradienten für jede 50 – ml – Rohr (2A). Zentrifuge bei 400 × g ohne Bremse bei 25 ° C für 30 min, dann sammeln die einkernigen Fraktion an der Flüssig-Flüssig-Grenzfläche und übertragen sie auf ein neues 50-ml-Röhrchen mit einer sterilen 5 ml Pipette. Waschen Sie die gesammelten einkernigen Fraktion zweimal mit komplettem Proliferationsmedium und Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 × g für 10 min bei 25 ° C Zellpellets zu erhalten. Überstand verwerfen und resuspendieren sanft jedes Zellpellet in 5 ml vollständigen Proliferationsmedium. Verdünnte bei einer 1: 100-Verhältnis für die Zellzählung. Zähle die Zellen mit einem Hämozytometer nach einer 1: 1-Verdünnung mit Trypan-Blau-Färbung der Zelllebensfähigkeit zu bewerten. 6. Kultur von hMSCs in Gegenwart von autologem Serum Füllen Sie zwei oder mehr 75 cm 2 Gewebekultur (TC) Fläschchen mit 15 ml frisches Vollproliferationsmedium und übertragen sie auf eine Zellkultur – Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 bis zur Verwendung. Seed 0.3   – 0,5 x 10 6 Zellen / cm 2 (37,5 x 10 6 Zellen / 15 ml frisches Vollproliferationsmedium) und bei 37 ° C und 5% CO 2 für 48 h inkubiert. Zur gleichen Zeit, seed 1 x 10 6 Zellen in einem 25 cm 2 TC – Kolben mit 5 ml frischem Komplettproliferationsmedium für die Colony Forming Unit – Fibroblast (CFU-F) Assays. Kultur für 2 Wochen (in § 12 fortgesetzt werden). Entsorgen Sie das Medium und vorsichtig waschen die Flaschen aus dem Schritt 6.2 mit komplettem Proliferationsmedium zu remove nonadherent Zellen und Trümmer. Fügen Sie frisches Medium in die Kolben und ersetzen die Hälfte davon zweimal in der Woche, bis 70-80% Konfluenz (Primärkultur, Passage 0 (P0)) (2B). Gewinnen Sie die Zellen mit einem spezifischen rekombinanten Tier freie Protease (siehe Tabelle der Materialien, verwendet werden 3 ml der Lösung pro Kolben , wie vom Hersteller empfohlen) und Inkubation bei 37 ° C und 5% CO 2 für 10 min. In 6 ml vollständigen Proliferationsmedium pro Kolben und sammeln sich in einem 50 ml-Röhrchen. Wiederholen Sie Schritt 5.6. Hinweis: Wichtig: Die Verwendung dieser Protease anstelle von Trypsin ermöglicht die Wiederherstellung einiger mesodermalen Vorläuferzellen (MPL) in der Kultur, die resistent ist Trypsin. Für die weitere Expansion, Ausstrich der Zellsuspension bei 2.000 – 3.000 Zellen / cm 2 in neue 75 cm 2 TC – Flaschen (P1) (Abbildung 2C). Verwenden Sie Teilmengen von Zellen, die die Differenzierungspotenziale von MSCs zu bewertenin Richtung osteogenen, adipogenetische und chondrogenen Abstammungslinien. Führen Sie Differenzierungsassays folgenden Empfehlungen des Herstellers (2D). HINWEIS: Unterschiedliche Färbungsmethoden können verwendet werden , multilineage Differenzierung zu bewerten. 7. Herstellung eines osteogenen Medium mit Pharmazie Verdünnte Ascorbinsäure-Lösung (Lösung 1A. Ascorbinsäure 200 mg / ml (Siehe Tabelle der Materialien) 1:10 mit DMEM-LG, erhalten eine 20 mg / ml Lösung (Lösung 1B, Arbeitslösung) Stock Aliquots von Lösungen 1A und 1B bei -20 ° C bis zur Verwendung. Resuspendieren 1 g Hydrocortison in 10 ml sterilem Wasser (Lösung 2A: Hydrocortison 100 mg / ml (Siehe Tabelle der Materialien) Verdünnen Sie die Lösung 2A bei . 1: 1000 mit DMEM-LG 100 ug / ml – Lösung (Lösung 2B zu erhalten, arbeiten Lösung). auf Aliquots von Lösungen 2A und 2B bei -20 ° C bis zur Verwendung. Bei Nutzung prepare frisch osteogenen Medium wie folgt: in DMEM-LG mit 10% autologem Serum, 50 ug / ml Ascorbinsäure und 0,4 ug / ml Hydrocortison. Sterile-Filter das osteogene Medium. 8. Osteogenisches Pre-Induktion und Gewinnung von hMSCs Vollständig das Proliferationsmedium entfernen und osteogenen Medium 96 h vor der Zellernte hinzufügen (dh 80 bis 90% Konfluenz in der Regel in 7 d erreicht ist). Einen zusätzlichen osteogenen Mediumwechsel 24 Stunden vor der Zellernte. Lösen Sie die Zellen wie in Schritt 6.5 beschrieben und resuspendieren sanft das Pellet Zugabe von 2 ml vollständigen Proliferationsmedium in einem 50 ml-Röhrchen. HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der Zellen kann (ca. 10%) reduziert werden kann als Ergebnis der Osteoinduktion. Zellaggregaten beobachtet werden. Nach dem Zählen, wasche die Zellen mit vollständigen Proliferationsmedium und Zentrifugation bei 300 × g für 5 min. Das Pellet vorsichtig mit einem 1 – 2 x 10 6 lebensfähigen Zellen / 2ml autologem Plasma pro 50 ml-Röhrchen (siehe Abschnitt 2). 9. Herstellung von hMSC / Fibringerinnsels Konstrukten Zugabe von 150 & mgr; l Calciumgluconat bei 100 mg / ml zu jedem Röhrchen 50 ml, erhalten aus Schritt 8.3. und Resuspendieren der Zellen unter leichtem Schütteln. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 15 – 30 min hMSC / Fibringerinnsel Konstrukten (3A) zu erhalten. Vorbereiten eines Fibringerinnsels Konstrukt ohne Zellen als Kontrolle verwendet werden. HINWEIS: WICHTIG: Es ist empfehlenswert , diese Steuer Gerinnsel mindestens 2 Stunden vor der Zelllebensfähigkeitstest herzustellen, wie es 30 Minuten oder mehr zur Vernetzung stattfindet. 10. Zell Viability Assay Entfernen Sie die Flüssigkeit aus den 50 ml – Röhrchen und 1 mL vollständigen Proliferationsmedium , das 10% v / v die Lebensfähigkeit der Zellen Reagenz (AB; siehe Tabelle der Materialien), nach den Richtlinien des Herstellers. inkubieren the Röhrchen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 3 Stunden. Messen der Extinktion bei 570 nm mit einer Referenzwellenlänge von 600 nm (AB zum Zeitpunkt 0; t0). Überstand verwerfen und mit 2 ml frischem vollständigen Proliferationsmedium. Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2 O / N. Am nächsten Tag (AB zum Zeitpunkt 24 h; t24), wiederholen Sie die Schritte 10.1 bis 10.3 (3B). 11. histologische Auswertung der Lebensfähigkeit der Zellen und Kalkablagerung innen Fibringerinnsels Konstrukten Befestigen Sie die hMSC / Fibringerinnsels Konstrukte in 4% w / v neutral gepuffertem Formalin O / N bei 4 ° C. Waschen Sie 4x in D-PBS für 15 min und Speicher in 70% Ethanol. Dehydratisieren der Proben bei 40 ° C in einer Serie von abgestuften Ethanol: 80% einmal für 30 min, 95% zweimal für 45 min und 100% für 1 h 3x. Klären zweimal in Xylol für 45 min bei 40 ° C. Spülen Sie die Proben in flüssigem Paraffin bei 60 ° C für 2 h und diese einbetten. Schneiden Sie den Paraffinblock mit einem Mikrotom und montieren ter Abschnitte (5 & mgr; m) auf Glasplatten. Stain die deparaffinisiert Abschnitte mit dem Standard – Hämatoxylin und Eosin (H & E) Verfahren (3C). Führen von Kossa-Färbung durch die Abschnitte mit 1% Silbernitrat für 15 min Behandlung, 0,5% Pyrogallol für 2 min und 5% Natriumthiosulfat für 2 min. Gegenfärbung der Schnitte mit 0,1% Kernechtrot in einer Lösung verdünnt, die 5 g Aluminiumsulfat für 5 Minuten und spülen Sie sie in Leitungswasser für 5 min. Montieren Sie die Abschnitte mit einem Befestigungsmittel. Bewerten Sie die Mineralabscheidung als schwarze Granulat unter dem Lichtmikroskop (400 – facher Vergrößerung) (3D). 12. CFU-F Assay Waschen Sie die 25 cm 2 Kolben (aus Schritt 6.3.) Mit D-PBS. Stain durch die Standard-May-Grunwald / Giemsa-Methode. HMSC Anzahl von einzelnen Kolonien Scoring (Abbildung 4) unter einem Lichtmikroskop visuell zu quantifizieren. HINWEIS: Wenndas Knochenmark ist, wie in Schritt 1.2 gemacht. und die Abschnitte 2 – 9 sind in der Good Manufacturing Practice (GMP) mit der notwendigen behördlichen Genehmigung durchgeführt, die hMSC / Fibringerinnsels Konstrukte können für orthopädische Anwendungen implantiert werden.