Mesenquimales estromales de cultivo celular y de entrega en autólogas Condiciones: Enfoque inteligente para aplicaciones ortopédicas

El presente protocolo fue desarrollado de acuerdo con la Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial en relación con la conducta ética de la investigación con seres humanos. Fue aprobado por el Comité Ético de la Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana. NOTA: La médula ósea se obtuvo de los pacientes sometidos a cirugía de reemplazo total de cadera rutina (según el paso 1.1) 15; plasma para la preparación de coágulos se obtuvo de la sangre periférica autóloga 13; suero autólogo, como un suplemento para medio de cultivo, se recogió de una aféresis de sangre entera autóloga. Todos los pacientes recibieron información detallada sobre el procedimiento y firmaron un formulario de consentimiento por escrito. 1. Recogida de la muestra de médula ósea Recoger la médula ósea del canal medular del fémur después de una cirugía de reemplazo total de cadera (para estudios de investigación). Brevemente, durante la preparación quirúrgica del canal medular a house el vástago protésico, recoger la sangre de la médula que se desborda (alrededor de 10 a 15 ml, dependiendo del tamaño de la prótesis) 15. O Recoger aspirado de médula ósea de la cresta ilíaca con anestesia local, siguiendo el procedimiento estándar acerca hematológica 20 – 30 d por adelantado (para aplicaciones clínicas) 16. NOTA: En ambos casos jeringas heparinizadas (para prevenir la formación de coágulos) debe ser utilizado para la recuperación de la médula ósea. 2. Preparación de plasma autólogo Recoger 20 ml de sangre periférica del paciente en tubos de recogida de sangre al vacío que contienen K3 EDTA (5,4 mg en 3 tubos ml) y se centrifuga a 2400 xg durante 15 min. Aspirar el componente de plasma en un tubo de 15 ml y se congelan a -20 ° C hasta su uso. 3. Preparación del suero autólogo La transferencia de la unidad de plasma en una bolsa de transferencia utilizando una espiga. Desconectar la bolsa llena por soldadura y el weigh la bolsa para calcular el volumen de plasma (Figura 1A). Coagular el plasma autólogo mediante la inyección de gluconato de calcio 100 mg / ml al 10% w / v a través del conector del puerto (Figura 1B). Después de mezclar la bolsa, lo coloca a 4 ° CO / N sin agitación para facilitar la formación de coágulos. Centrifugar la bolsa a 4.900 × g durante 15 min a TA. Tome el cubo de centrífuga de la centrifugadora y retirar la bolsa con cuidado (siga las instrucciones del fabricante para la preparación de lisado de plaquetas) (Figura 1C). Aislar el coágulo justo por encima de la abrazadera para facilitar la filtración. Conectar el kit de filtración a la bolsa de transferencia usando un pico colocado en el orificio de salida del kit de filtración. Colgar la bolsa y abrir la pinza azul para permitir que el flujo de suero por gravedad. No aplique presión en el filtro para evitar la transferencia de la fibrina en la bolsa. Después de la filtración, sellar el tubo y retirar la bolsa (seguir la fabridirectrices del fabri- para la preparación de lisado de plaquetas). Conectar una línea dedicada a la bolsa y la transferencia final del suero en tubos de 50 ml bajo un banco de flujo laminar para evitar la contaminación microbiana. Tomar una muestra con una jeringa para probar la ausencia de fibrinógeno y realizar una prueba de esterilidad para cultivos de bacterias aerobias y anaerobias 17. Etiquetar los tubos de manera adecuada y congelarlos a – 20 ° C hasta su uso. 4. Preparación del medio de expansión Preparar 500 ml de medio de proliferación completa. Para de Eagle modificado por Dulbecco – bajo en glucosa (DMEM-LG), añadir un 10% de suero autólogo (obtenido como se describe en la sección 3), glutamina 2 mM, solución antibiótica 1% y una solución antimicótica 1%. Estéril-filtro el medio proliferación completa. 5. Aislamiento de hMSC de la médula ósea Transferir la muestra de médula ósea (5-10 ml) de la jeringa en un ml cónica 50 tuser y diluir con solución salina estéril (relación 1: 4). Vortex el tubo de 50 ml durante 30 s para desagregar los grupos de células. Calentar el gradiente de densidad (densidad 1,077 g / L; véase la Tabla de Materiales) a RT antes de su uso y la capa de la médula ósea diluida suavemente (para evitar que se mezclen las dos capas) en el gradiente de densidad mediante la adición de 20 ml de la muestra a 15 ml de la densidad gradiente para cada tubo de 50 ml (Figura 2A). Centrifugar a 400 x g sin frenos a 25 ° C durante 30 min, y luego recoger la fracción mononuclear en la interfase líquido-líquido y la transferencia a un nuevo tubo de 50 ml utilizando un 5 ml pipeta estéril. Lavar la fracción mononuclear recogido dos veces con medio de proliferación completa y centrifugar los tubos a 400 xg durante 10 min a 25 ° C para obtener gránulos de las células. Eliminar el sobrenadante y resuspender suavemente cada sedimento de células en 5 ml de medio de proliferación completa. Diluir a una proporción de 1: 100 para el recuento celular. Contar las células usando un hemocitómetro después de una dilución 1: 1 con la tinción de azul de tripano para evaluar la viabilidad celular. 6. cultivo de hMSC en presencia de suero autólogo Llenar dos o más frascos (TC) 75 cm 2 de cultivo de tejidos con 15 ml de medio de proliferación completo fresco y transferirlos a una incubadora de cultivo celular a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta su uso. semilla 0,3   – 0,5 x 10 6 células / cm2 (37,5 x 10 6 células / 15 ml de medio de proliferación completo fresco) y se incuba a 37 ° C y 5% de CO2 durante 48 h. Al mismo tiempo, la semilla 1 x 10 6 células en un 25 cm matraz de 2 TC con 5 ml de medio de proliferación completo fresco para la unidad formadora de colonias – fibroblastos (CFU-F) de ensayo. Cultivo durante 2 semanas (continuará en la sección 12). Descartar el medio y lavar suavemente los frascos desde el paso 6.2 con el medio de proliferación completa a remove células no adherentes y los escombros. Añadir medio fresco a los matraces y reemplazar medio de dos veces a la semana, hasta 70-80% de confluencia (cultivo primario, Passage 0 (P0)) (Figura 2B). Recuperar las células mediante el uso de un animal recombinante libre de proteasa específica (véase la Tabla de materiales, el uso de 3 ml de la solución por frasco según lo recomendado por el fabricante) y se incuba a 37 ° C y 5% de CO2 durante 10 min. Añadir 6 ml de medio de proliferación completa por matraz y se juntan en un tubo de 50 ml. Repita el paso 5.6. NOTA: IMPORTANTE: El uso de esta proteasa en lugar de tripsina permite la recuperación de algunas células mesodérmicas progenitores (PSM) presentes en la cultura, que es resistente a la tripsina. Para una mayor expansión, replate la suspensión celular a 2.000 – 3.000 células / cm2 en nueva 75 cm 2 frascos de TC (P1) (Figura 2C). Use alícuotas de células para evaluar el potencial de diferenciación de las MSChacia osteogénico, adipogénico y linajes condrogénicas. Realizar ensayos de diferenciación siguiendo las recomendaciones del fabricante (Figura 2D). NOTA: Diferentes métodos de tinción se pueden utilizar para evaluar la diferenciación multilinaje. 7. Preparación de un medio osteogénico con suplementos farmacéuticos Diluir la solución de ácido ascórbico (Solución 1A:. Ácido ascórbico 200 mg / ml (véase la Tabla de Materiales) 1:10 con DMEM-LG, para obtener una solución 20 mg / ml (Solución 1B, solución de trabajo) alícuotas de archivo de soluciones 1A y 1B a -20 ° C hasta su uso. Resuspender 1 g de hidrocortisona en 10 ml de agua estéril (Solución 2A: hidrocortisona 100 mg / ml (Véase la Tabla de Materiales) una solución diluida de 2A a 1:. 1000 con DMEM-LG para obtener una solución / mL 100 mg (Solución 2B, trabajando solución). alícuotas de archivo de soluciones 2A y 2B a -20 ° C hasta su uso. Tras el uso de prepare medio osteogénico fresco como sigue: añadir DMEM-LG con suero autólogo al 10%, ácido ascórbico 50 mg / ml y 0,4 mg / ml de hidrocortisona. Esterilizada por el filtro del medio osteogénico. 8. osteogénico Pre-inducción y recuperación de hMSCs Eliminar completamente el medio de proliferación y añadir osteogénicas medianas 96 h antes de la cosecha de células (es decir, 80-90% de confluencia se alcanza generalmente en 7 d). Proporcionar un cambio de medio osteogénico adicional de 24 h antes de la recolección de células. Separar las células como se describe en el paso 6.5 y volver a suspender suavemente el sedimento de la adición de 2 ml de medio de proliferación completa en un tubo de 50 ml. NOTA: La viabilidad celular se puede reducir (aproximadamente 10%) como un resultado de la osteoinducción. agregados celulares pueden ser observados. Después de contar, lavar las células con medio de proliferación completa y centrifugar a 300 xg durante 5 min. Resuspender el precipitado suavemente a 1 – 2 x 10 6 células viables / 2ml de plasma autólogo (véase la sección 2) por un tubo de 50 ml. 9. Preparación de hMSC / coágulo de fibrina Constructos Añadir 150 l de gluconato de calcio a 100 mg / ml a cada tubo 50 ml obtenido en la etapa 8.3. y resuspender las células bajo agitación suave. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 15 – 30 min para obtener / fibrina construcciones coágulo de hMSC (Figura 3A). Preparar una construcción de coágulo de fibrina sin células para ser utilizado como un control. NOTA: IMPORTANTE: Es recomendable para preparar este coágulo de control de al menos 2 h antes de que el ensayo de viabilidad celular, ya que toma 30 min o más para reticulación. Ensayo de viabilidad de la célula 10. Retire el líquido de los tubos de 50 ml y se añade 1 ml de medio de proliferación completo que contiene 10% v reactivo de la viabilidad celular / v (AB; véase la Tabla de Materiales), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. incubar THtubos electrónicos a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 3 h. Medir la absorbancia a 570 nm con una longitud de onda de referencia de 600 nm (AB en el tiempo 0; t0). Eliminar el sobrenadante y añadir 2 ml de medio de proliferación completo fresco. Se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 O / N. Al día siguiente (AB en horario de 24 h; t24), repita los pasos 10.1 a 10.3 (Figura 3B). 11. La evaluación histológica de la viabilidad celular y la deposición de calcio en el interior del coágulo de fibrina constructos Fijar los / las construcciones de fibrina del coágulo hMSC en 4% w / v de formalina neutra tamponada O / N a 4 ° C. Lave 4 veces en D-PBS durante 15 min y almacenar en un 70% de etanol. Deshidratar las muestras a 40 ° C en una serie de etanol graduado: 80% de una vez por 30 min, 95% dos veces durante 45 min y 3 x 100% durante 1 h. Aclarar dos veces en xileno durante 45 min a 40 ° C. Enjuague las muestras en parafina líquida a 60 ° C durante 2 h, y incrustarlos. Cortar el bloque de parafina con un microtomo y monte tél secciones (5 micras) sobre portaobjetos de vidrio. Teñir los cortes desparafinados utilizando el eosina (H & E) método (Figura 3C) estándar de hematoxilina. Realizar tinción de von Kossa por el tratamiento de las secciones con 1% de nitrato de plata durante 15 minutos, 0,5% de pirogalol para 2 min, y tiosulfato de sodio al 5% durante 2 min. CONTRATINCIÓN las secciones con 0,1% de rojo nuclear diluido en una solución que contiene 5 g de sulfato de aluminio durante 5 minutos y enjuague con agua del grifo durante 5 minutos. Montar las secciones con un agente de montaje. Evaluar la deposición de minerales en forma de gránulos negros bajo microscopio óptico (400 aumentos) (Figura 3D). Ensayo 12. CFU-F Lavar el matraz de 25 cm2 (desde el paso 6.3.) Con D-PBS. Teñir utilizando el método estándar May-Grunwald / Giemsa. Cuantificar visualmente número hMSC al anotar colonias individuales (Figura 4) con un microscopio óptico. NOTA: Sila médula ósea se toma como en el paso 1.2. y las secciones 2 – 9 se realizan en Buenas Prácticas de Fabricación (BPF) con la aprobación regulatoria necesaria, los / las construcciones de fibrina del coágulo hMSC se pueden implantar para aplicaciones ortopédicas.