Mesenchimali stromali coltura cellulare e la consegna in autologhi Condizioni: un approccio intelligente per applicazioni ortopediche

Il presente protocollo è stato sviluppato secondo la dichiarazione dell'Associazione medica mondiale la di Helsinki per quanto riguarda la condotta etica degli esseri umani di ricerca che coinvolge. E 'stato approvato dal Comitato Etico dell'Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana. NOTA: Il midollo osseo è stato ottenuto da pazienti sottoposti a intervento chirurgico di routine totale sostituzione dell'anca (in base al punto 1.1) 15; plasma per la preparazione coagulo è stato ottenuto da sangue periferico autologo 13; siero autologo, come un supplemento per il terreno di coltura, è stato raccolto da un autologo aferesi di sangue intero. Tutti i pazienti hanno ricevuto informazioni dettagliate sulla procedura e hanno firmato un modulo di consenso per iscritto. 1. Raccolta del campione di midollo osseo Raccogliere il midollo osseo dal canale midollare del femore dopo un intervento chirurgico di sostituzione totale dell'anca (per studi di ricerca). Brevemente, durante la preparazione chirurgica del canale midollare di hOuse stelo protesico, raccogliere il sangue osseo che trabocca (circa 10 – 15 mL, a seconda delle dimensioni della protesi) 15. O Raccogliere aspirato midollare dalla cresta iliaca in anestesia locale, seguendo la procedura standard ematologica circa 20 – 30 d in anticipo (per applicazioni cliniche) 16. NOTA: In entrambi i casi le siringhe eparinizzate (per prevenire la formazione di coaguli) devono essere utilizzati per il recupero del midollo osseo. 2. Preparazione di autologo Plasma Raccogliere 20 ml di sangue periferico del paziente in provette per la raccolta di sangue sotto vuoto contenenti K3 EDTA (5,4 mg in 3 mL) e centrifugare a 2400 g per 15 min. Aspirare il componente del plasma in una provetta da 15 ml e congelare a -20 ° C fino al loro utilizzo. 3. Preparazione del autologo Serum Trasferire l'unità di plasma in una sacca di trasferimento mediante un picco. Scollegare il sacco riempito da saldatura e Weigh il sacchetto per calcolare il volume di plasma (Figura 1A). Coagulare il plasma autologo iniettando gluconato di calcio 100 mg / ml a 10% w / v attraverso il connettore della porta (Figura 1B). Dopo la miscelazione la borsa, metterlo a 4 ° CO / N senza agitazione per facilitare la formazione di coaguli. Centrifugare la borsa a 4.900 xg per 15 minuti a RT. Prendere il secchio centrifuga fuori della centrifuga e rimuovere il sacchetto attenzione (seguire le linee guida del produttore per la preparazione di lisato piastrinico) (Figura 1C). Isolare il coagulo appena sopra il morsetto per facilitare la filtrazione. Collegare il kit di filtrazione alla sacca di trasferimento usando un picco posizionato nella porta di uscita del kit di filtrazione. Appendere la borsa ed aprire il morsetto blu per lasciare che il flusso di siero per gravità. Non applicare una pressione al filtro per evitare il trasferimento di fibrina nel sacchetto. Dopo filtrazione, sigillare il tubo e rimuovere il sacchetto (seguire la produzionle linee guida pre- scrizioni per la preparazione di lisato piastrinico). Collegare una linea dedicata alla sacca e trasferimento siero finale in 50 mL sotto un banco a flusso laminare per evitare la contaminazione microbica. Prendere un campione con una siringa per verificare l'assenza di fibrinogeno ed eseguire un test di sterilità per colture batteriche aerobiche e anaerobiche 17. Etichettare i tubi in modo appropriato e congelarli a – 20 ° C fino a quando l'utilizzo. 4. Preparazione del Piano di espansione Preparare 500 ml di terreno di proliferazione completo. Per Modified Eagle Medium di Dulbecco – basso livello di glucosio (DMEM-LG), aggiungere il 10% di siero autologo (ottenuto come descritto nella sezione 3), 2 mM glutammina, 1% soluzione antibiotica e l'1% soluzione antimicotica. Sterile-filtro del mezzo di proliferazione completo. 5. Isolamento di hMSCs dal midollo osseo Trasferire il campione di midollo osseo (5 – 10 mL) dalla siringa in un ml conica 50 tuessere e diluire con soluzione fisiologica sterile (rapporto 1: 4). Agitare il tubo da 50 ml per 30 s di disaggregare i gruppi di cellule. Riscaldare il gradiente di densità (densità 1.077 g / L; vedere Tabella dei materiali) per RT prima dell'uso e sovrapporre il midollo osseo diluito delicatamente (per evitare la miscelazione entrambi gli strati) sul gradiente di densità aggiungendo 20 mL di campione 15 mL di densità gradiente per ogni tubo da 50 ml (Figura 2A). Centrifugare a 400 xg senza freno a 25 ° C per 30 minuti, quindi recuperare la frazione mononucleare all'interfaccia liquido-liquido e trasferirlo in un tubo da 50 ml usando una sterile 5 mL pipetta. Lavare la frazione mononucleare raccolti due volte con il mezzo proliferazione completo e centrifugare le provette a 400 × g per 10 min a 25 ° C per ottenere pellet cellulari. Eliminare il surnatante e risospendere delicatamente ogni pellet di cellule in 5 ml di terreno di proliferazione completo. Diluire in un rapporto di 1: 100 per la conta cellulare. Contare le cellule utilizzando un emocitometro dopo una diluizione 1: 1 con Trypan Blue colorazione per valutare la vitalità cellulare. 6. Cultura del hMSCs in presenza di siero autologo Riempire due o più flaconi (TC) 75 cm 2 di coltura tissutale con 15 ml di terreno di proliferazione completo fresco e trasferirli ad un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C e 5% CO 2 fino utilizzo. Seed 0.3   – 0.5 x 10 6 cellule / cm 2 (37,5 x 10 6 cellule / 15 ml di mezzo completo proliferazione fresca) e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 48 ore. Allo stesso tempo, seme 1 x 10 6 cellule in cm 25 pallone da 2 TC con 5 ml di terreno di proliferazione completa fresche Unità Formanti Colonia – Fibroblast (CFU-F) dosaggio. Cultura per 2 settimane (Continua nella sezione 12). Eliminare il medio e lavare delicatamente i flaconi dal punto 6.2 con mezzo completo proliferazione di remil sobrio cellule non aderenti e detriti. Aggiungere mezzo fresco nei flaconi e sostituire la metà di due volte a settimana, fino 70 – 80% di confluenza (coltura primaria, Passaggio 0 (P0)) (Figura 2B). Recupero delle celle utilizzando una specifica proteasi animale ricombinante (vedere Tabella dei materiali; utilizzare 3 mL della soluzione per bombola come raccomandato dal produttore) e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 10 min. Aggiungere 6 ml di terreno di proliferazione completo per bombola e raccogliere in un tubo da 50 ml. Ripetere il punto 5.6. NOTA: IMPORTANTE: L'uso di questo proteasi invece di tripsina permette il recupero di alcune cellule mesodermal progenitori (PPM) presenti nella cultura, che è tripsina resistente. Per ulteriore espansione, replate la sospensione cellulare a 2.000 – 3.000 cellule / cm 2 nel nuovo 75 centimetri 2 TC palloni (P1) (Figura 2C). Utilizzare aliquote di cellule per valutare le potenzialità di differenziazione delle cellule staminali mesenchimaliverso osteogenico, adipogenico e lignaggi condrogeniche. Effettuare test di differenziazione seguenti raccomandazioni del produttore (Figura 2D). NOTA: Diversi metodi di colorazione possono essere utilizzati per valutare la differenziazione multilineare. 7. Preparazione di un mezzo osteogenico con complementi farmaceutici Diluire soluzione di acido ascorbico (Soluzione 1A:. Acido ascorbico 200 mg / ml (vedi tabella dei materiali) 1:10 con DMEM-LG, per ottenere una soluzione di 20 mg / ml (Soluzione 1B, soluzione di lavoro) aliquote fotografici di soluzioni 1A e 1B a -20 ° C fino al loro utilizzo. Risospendere 1 g idrocortisone in 10 ml di acqua sterile (soluzione 2A: idrocortisone 100 mg / ml (vedere tabella dei materiali) diluita 2A a 1:. 1.000 con DMEM-LG per ottenere una soluzione / mL 100 mg (Solution 2B, lavorando soluzione). aliquote fotografici di soluzioni 2A e 2B a -20 ° C fino al loro utilizzo. Su utilizzo prepare fresco mezzo osteogenico come segue: aggiungere DMEM-LG con 10% di siero autologo, acido ascorbico / ml 50 mg e 0,4 mg / ml idrocortisone. Sterile-filtro del mezzo osteogenico. 8. Osteogenic pre-induzione e recupero di hMSCs Completamente rimuovere il supporto di proliferazione e aggiungere osteogeniche media 96 h prima della raccolta delle cellule (ad esempio, l'80 – 90% confluenza di solito è raggiungibile in 7 d). Fornire un secondo cambio medio osteogenico 24 ore prima raccolta di cellule. Staccare le cellule come descritto al punto 6.5 e delicatamente risospendere il pellet aggiungendo 2 mL di terreno proliferazione completa in un tubo da 50 ml. NOTA: La vitalità cellulare può essere ridotta (circa il 10%) come risultato di osteoinduzione. aggregati cellulari possono essere osservati. Dopo il conteggio, lavare le cellule con mezzo proliferazione completo e centrifugare a 300 g per 5 min. Risospendere il pellet delicatamente a 1 – 2 x 10 6 cellule vitali / 2ml di plasma autologo (vedere paragrafo 2) per tubo da 50 ml. 9. Preparazione di hMSC / coagulo di fibrina costrutti Aggiungere 150 ml di gluconato di calcio a 100 mg / ml per ogni provetta 50 mL ottenuta dalla fase 8.3. e risospendere le cellule sotto agitando delicatamente. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per 15 – 30 min per ottenere hMSC / fibrina costrutti coagulo (Figura 3A). Preparare un coagulo di fibrina costrutto senza cellule da utilizzare come controllo. NOTA: IMPORTANTE: Si raccomanda di preparare questo coagulo di controllo almeno 2 ore prima del test vitalità cellulare, come ci vogliono 30 minuti o più per reticolazione. 10. vitalità cellulare Assay Rimuovere il liquido dai tubi da 50 ml e aggiungere 1 ml di terreno di proliferazione completo contenente il 10% di reagente v / v vitalità cellulare (AB; vedi Tabella dei Materiali), secondo le linee guida del produttore. incubare °e provette a 37 ° C e 5% di CO 2 per 3 h. Misurare l'assorbanza a 570 nm con una lunghezza d'onda di riferimento a 600 nm (AB al tempo 0; t0). Eliminare il surnatante e aggiungere 2 ml di terreno di proliferazione completo fresco. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 O / N. Il giorno successivo (AB in fase di 24 ore, T24), ripetere i passaggi 10,1-10,3 (Figura 3B). 11. istologica Valutazione della vitalità cellulare e deposizione di calcio all'interno di coagulo di fibrina costrutti Fissare le / fibrina costrutti coagulo hMSC a 4% w / v formalina neutra tamponata O / N a 4 ° C. Lavare 4x in D-PBS per 15 min e conservare in etanolo al 70%. Disidratare i campioni a 40 ° C in una serie di etanolo graduata: 80% una volta per 30 min, 95% per due volte per 45 min e 3x 100% per 1 h. Chiarire due volte in xilene per 45 min a 40 ° C. Risciacquare i campioni in paraffina liquida a 60 ° C per 2 h ed integrarli. Tagliare il blocco di paraffina con un microtomo e montare tegli sezioni (5 micron) su vetrini. Macchiare le sezioni deparaffinate utilizzando lo standard ematossilina e il metodo eosina (H & E) (Figura 3C). Eseguire von Kossa colorazione trattando le sezioni con 1% di nitrato d'argento per 15 min, 0,5% Pyrogallol per 2 min e 5% di sodio tiosolfato per 2 min. Controcolorare sezioni con 0,1% di rosso nucleare diluito in una soluzione contenente 5 g di solfato di alluminio per 5 minuti e sciacquare in acqua corrente per 5 min. Montare le sezioni con un agente di montaggio. Valutare la deposizione di minerali sotto forma di granuli neri sotto microscopio ottico (400X ingrandimento) (Figura 3D). 12. CFU-F Assay Sciacquare il pallone 25 centimetri 2 (dal punto 6.3.) Con D-PBS. Macchia utilizzando il metodo May-Grunwald / Giemsa standard. Visivamente quantificare il numero hMSC segnando singole colonie (Figura 4) sotto un microscopio ottico. NOTA: Seil midollo osseo è preso come al punto 1.2. e le sezioni 2-9 sono eseguiti in Good Manufacturing Practice (GMP) con la necessaria approvazione normativa, i / fibrina costrutti coagulo hMSC possono essere impiantati per applicazioni ortopediche.