自家条件で間葉系幹細胞の培養および配信：整形外科アプリケーションのためのスマートなアプローチ

現在のプロトコルは、人間が関与する研究の倫理に関するヘルシンキの世界医師会の宣言に基づいて開発されました。これは、AziendaメールOspedaliero-Universitàriaにピサーナの倫理委員会によって承認されました。 注意： 骨髄は、15（ステップ1.1に記載の）ルーチン股関節全置換術を受けた患者から入手しました。血餅を調製するためのプラズマは、自己末梢血13から得られました。自己血清は、培養培地のためのサプリメントとして、自己全血アフェレーシスから収集しました。すべての患者は、手順に関する詳細な情報を受信し、書面による同意書に署名しました。 骨髄試料の1コレクション （調査研究のための）人工股関節全置換手術後に大腿骨髄管から骨髄を収集します。 hまで髄管の外科的準備中に簡単に説明すると、（ -人工器官の大きさに応じて15 mLを、約10）15を補綴ステムをウーズ、オーバーフロー骨髄血を集めます。 OR （臨床応用のために）事前に30 D 16から20程度の標準的な血液学的手順に従って、局所麻酔下での腸骨稜から骨髄吸引液を収集します。 注：両方の場合において（血餅形成を防止する）ヘパリン処理シリンジは、骨髄回復のために使用されなければなりません。 自己血漿の調製 15分間、2400×gでK3 EDTA（3 mLチューブで5.4 mg）を、遠心分離を含む真空採血管で患者からの末梢血20mLのを収集します。 15 mLチューブ中の血漿成分を吸引し、使用まで-20℃で凍結します。 自己血清の調製スパイクを使用して転送バッグにプラズマの単位を転送します。溶接とweigによって満たされた袋を外します血漿（ 図1A）の体積を計算する時間のバッグ。 ポートコネクタ（ 図1B）を介しw / vの 10％で100ミリグラム/ mLのグルコン酸カルシウムを注入することにより自己血漿を凝固。袋を混合した後、血栓形成を促進するために、振とうせずに4°CO / Nでそれを配置します。 RTで15分間、4900×gでバッグを遠心分離します。遠心分離機のうち、遠心分離バケツを取り、慎重に袋を取り外します（血小板溶解物の調製のために、製造元のガイドラインに従ってください）（ 図1C）。 ろ過を容易にするためだけでクランプの上に凝血塊を分離します。ろ過キットの出口ポートに配置されたスパイクを使用して転送バッグにろ過キットを接続します。 バッグを掛けると、重力によって血清の流れをできるように、青色クランプを開きます。袋にフィブリンの転送を回避するために、フィルタに圧力をかけないでください。濾過後、チューブを密封し、バッグを削除（manufacに従ってください血小板溶解物の調製のための造業者のガイドライン）。 微生物汚染を避けるために層流ベンチ下、50 mLの試験管に最終バッグや転送血清に専用回線を接続します。 フィブリノゲンが存在しないことをテストし、好気性と嫌気性細菌培養物17のための無菌試験を行うためにシリンジでサンプルを取ります。適切チューブにラベルを付け、でそれらを凍結 – 20°Cまで使用。 拡張中の4準備完全増殖培地の500ミリリットルを準備します。ダルベッコ改変イーグル培地に – 低グルコース（DMEM-LG）、（セクション3で説明したようにして得られた）10％自己血清、2mMグルタミン、1％抗生物質溶液と1％の抗真菌剤溶液を添加します。滅菌フィルタの完全増殖培地。 骨髄からのhMSCの5の単離 50 mLコニカルTUシリンジから – （10 mLの5）骨髄サンプルを移しよく、滅菌生理食塩水でそれを希釈（比1：4）。 30秒は、細胞塊を脱凝集するための50 mLチューブをボルテックス。 密度の15 mLにサンプルを20mLを加えることによって、使用前に室温に、静かに希釈された骨髄を層（両層を混合を防ぐために）密度勾配上に、密度勾配（ 材料の表を参照してください密度1.077グラム/ L）を温めます各50 mLチューブ用の勾配（ 図2A）。 30分間25℃でブレーキなしで400×gで遠心分離し、液 – 液界面での単核画分を回収し、滅菌5mLのピペットを使用して、新しい50 mLチューブに移します。 完全増殖培地で2回採取し、単核画分を洗浄し、細胞ペレットを得るために、25℃で10分間、400×gでチューブを遠心します。 上清を捨て、軽く完全増殖培地5mLに、各細胞ペレットを再懸濁します。細胞計数のために100：1の比率で希釈します。 細胞生存率を評価するためにトリパンブルー染色で1希釈：1の後に血球計数器を用いて細胞を数えます。 自家血清の存在下でのhMSCの6.文化二つ以上の75cm 2の組織培養（TC）を満たす使用するまでCO 2新鮮な完全増殖培地の15 mLのフラスコ、37℃で細胞培養インキュベーターに転送し、5％。 シード0.3   – X 10 0.5 6細胞/ cm 2（37.5×10 6細胞/新鮮な完全増殖培地の15 mL）中、37℃でインキュベートし、5％CO 2で48時間インキュベートしました。 同時に、コロニー形成単位のための新鮮な完全増殖培地5mlで25cm 2のTCフラスコ中の種子1×10 6細胞-線維芽細胞（CFU-F）アッセイ。 2週間の培養は、（セクション12で継続されます）。 培地を捨て、軽くレムへの完全増殖培地でステップ6.2からフラスコを洗います非付着細胞および破片をOVE。フラスコに新鮮な培地を追加し、70まで、1週間に2回、それの半分を交換- 80％の集密度（初代培養、継代0（P0））（ 図2B）。 10分間、37℃でインキュベートし、5％CO 2、特定の組換え動物無料のプロテアーゼを使用して細胞を回収（製造業者により推奨されるように、フラスコあたり3mLの溶液を使用する材料の表を参照してください）。フラスコ当たりの完全増殖培地6 mLと1 50mLのチューブに収集します。繰り返し手順5.6。 注：重要：代わりに、トリプシンのこのプロテアーゼの使用が耐性トリプシンされ、培養物中に存在するいくつかの中胚葉前駆細胞の細胞（MPCは）、の回収を可能にします。 新しい75cm 2のTCフラスコ（P1）中/ cm 2と（ 図2C）3000細胞-さらなる拡大のため、2000で細胞懸濁液をreplate。 MSCの分化能を評価するために、細胞のアリコートを使用し骨形成、脂肪生成および軟骨形成系列に向けて。メーカーの推奨（ 図2D）は、次の分化アッセイを行います。 注：異なる染色方法は、多分化を評価するために使用することができます。 製薬サプリメントと骨形成培地の7の準備アスコルビン酸溶液（希釈溶液1A：アスコルビン酸を200mg / mlの（）は、20ミリグラム/ mL溶液（溶液1Bを得るために、DMEM-LGでの作業溶液を材料表 ）1:10参照溶液1Aのストックのアリコートおよび使用するまで-20℃で1B。 滅菌水10mLで再懸濁1グラムのヒドロコルチゾン（解決策2A：ヒドロコルチゾン100 mg / mlで（ 材料の表を参照してください）希薄溶液2A 1：千DMEM-LGと100μg/ mLの溶液を得（解決策2B、作業溶液）。使用まで-20℃でのソリューション2A、2Bの株価アリコート。 使用目的Pの際次のように新鮮な骨形成培地をrepare：10％自己血清、50μg/ mlのアスコルビン酸および0.4μgの/ mLのヒドロコルチゾンを含むDMEM-LGを追加します。滅菌フィルター骨形成培地。 8.骨形成誘導前とのhMSCの回復完全増殖培地を除去し、細胞収穫前に骨形成培地96時間を追加する（ すなわち、百分の80から90までの集密度は、通常7（d）に達しました）。追加の骨形成培地変化を細胞収穫前に24時間を提供します。 ステップ6.5で説明した、軽く50 mLの試験管に完全増殖培地2mlを追加するペレットを再懸濁として細胞を切り離します。 注：細胞生存率は、骨誘導の結果（約10％）減少させることができます。細胞凝集体を観察することができます。 カウントした後、5分間300×gで、完全増殖培地と遠心で細胞を洗浄。 2×10 6生細胞/ 2から1に静かにペレットを再懸濁自己血漿のmLを50 mLチューブあたり（セクション2を参照します）。 hMSC /フィブリンクロット構築物の9準備ステップ8.3から得られた各50mLのチューブに100ミリグラム/ mLでグルコン酸カルシウムの150μLを加えます。そして、穏やかに振盪下で細胞を再懸濁。 （ 図3A）のhMSC /フィブリン塊構築物を得るために30分- 15 37℃で細胞を、5％CO 2でインキュベートします。対照として使用する細胞を含まないフィブリン塊構築物を調製します。 注：重要：架橋する30分以上を要するように、細胞生存率アッセイの前に、この制御血餅少なくとも2時間を調製することが推奨されます。 10.細胞生存率アッセイ 50 mLチューブから液体を除去し、10％（v / v）の細胞生存率の試薬を含む完全増殖培地の1 mLを加え（ABを、 材料の表を参照）、製造業者のガイドラインに従って。 目をインキュベート3時間37℃、5％CO 2でEチューブ。 （時間0でAB; T0）600nmでの参照波長570 nmの吸光度を測定します。 上清を捨て、新鮮な完全増殖培地2mlを追加します。 37℃、5％CO 2、O / Nでインキュベートします。次の日（AB時で24時間; T24）は、リピートは10.3（ 図3B）に10.1を繰り返します。 フィブリンクロット構築内部の細胞生存率およびカルシウム沈着の11組織学的評価 4°Cでのw / vの中性緩衝ホルマリンO / N 4％のhMSC /フィブリン塊の構造を修正しました。 70％エタノール中で15分間、店舗用のD-PBSで洗浄4倍。 45分間、二回30分間に一度、80％、95％、1時間に100％を3倍：段階的エタノールシリーズで、40℃でサンプルを脱水します。 40℃で45分間、キシレンで二度明確にします。 2時間、60℃で液体パラフィン中にサンプルを洗浄し、それらを組み込みます。トンミクロトームでパラフィンブロックをカットし、マウントガラススライド上の彼のセクション（5ミクロン）。 標準的なヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）法（ 図3C）を使用して脱パラフィン化セクションを染色します。 2分間0.5％ピロガロール、15分間、1％硝酸銀で切片を処理することにより、フォン・コッサ染色を行い、そして2分間5％チオ硫酸ナトリウム。 5分間5gの硫酸アルミニウムを含有する溶液中で希釈した0.1％核ファーストレッドで切片を対比染色し、5分間水道水でそれらをすすぎます。封入剤でセクションをマウントします。 光顕微鏡（400X倍率）（ 図3D）の下に黒い顆粒などのミネラル沈着を評価します。 12. CFU-Fアッセイ D-PBSで（ステップ6.3から）25cm 2のフラスコを洗います。標準メイグリュンワルド/ギムザ法を用いて染色します。視覚的、光学顕微鏡下で個々のコロニー（ 図4）をスコアリングすることによりhMSCの数を定量化します。 注：もし骨髄は、ステップ1.2と同様に行われます。そして、セクション2から9までは、必要な規制当局の承認を得て適正製造基準（GMP）で行われ、hMSCの/フィブリン塊構築物は、整形外科用途のために移植することができます。