Estromais mesenquimais cultura de células e Entrega em condições autólogas: Uma abordagem inteligente para aplicações ortopédicas

O presente protocolo foi desenvolvido em conformidade com a Declaração da Associação Médica Mundial de Helsinki sobre a conduta ética de pesquisa envolvendo seres humanos. Ele foi aprovado pelo Comitê de Ética da Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana. NOTA: A medula óssea foi obtida de pacientes submetidos a cirurgia de substituição total do quadril de rotina (de acordo com o passo 1.1) 15; plasma para a preparação do coágulo foi obtido a partir de sangue periférico autólogos 13; soro autólogo, como um suplemento para o meio de cultura, foram coletados a partir de uma aférese de sangue total autólogo. Todos os pacientes receberam informações detalhadas sobre o procedimento e assinaram um termo de consentimento por escrito. 1. Recolha da Amostra de Medula Óssea Recolha de medula óssea do canal medular femoral após uma cirurgia de substituição total do quadril (para estudos de investigação). Resumidamente, durante a preparação cirúrgica do canal medular para house a haste de prótese, recolher o sangue da medula que transborda (cerca de 10 – 15 ml, dependendo do tamanho da prótese) 15. OU Recolhe aspirado de medula óssea da crista ilíaca, sob anestesia local, seguindo o procedimento padrão hematológica cerca de 20 – 30 d antecipadamente (para aplicações clínicas) 16. NOTA: Em ambos os casos seringas heparinizadas (para evitar a formação de coágulos) deve ser utilizado para a recuperação de medula óssea. 2. Preparação de autólogo de Plasma Recolha de 20 ml de sangue periférico do paciente em tubos de recolha de sangue de vácuo contendo EDTA K3 (5,4 mg em 3 tubos mL) e centrifugar a 2400 x g durante 15 min. Aspirar o componente de plasma num tubo de 15 mL e congelar a -20 ° C até utilização. 3. Preparação do soro autólogo Transferir a unidade de plasma para um saco de transferência usando um pico. Desligue o saco cheio de soldagem e weigh, o saco para calcular o volume de plasma (Figura 1A). Coagular o plasma autólogo por injecção de gluconato de cálcio 100 mg / mL a 10% w / v através do conector da porta (Figura 1B). Após a mistura no saco, coloque-o a 4 ° CO / N sem agitação para facilitar a formação do coágulo. Centrifuga-se o saco em 4900 × g durante 15 min à temperatura ambiente. Leve o balde centrífuga para fora da centrífuga e retirar o saco com cuidado (siga as orientações do fabricante para a preparação de ligado de plaquetas) (Figura 1C). Isolar o coágulo logo acima da braçadeira para facilitar a filtração. Ligue o kit de filtração para o saco de transferência usando um espigão colocado na porta de saída do kit de filtração. Pendurar o saco e abra a braçadeira azul para deixar o fluxo de soro por gravidade. Não aplicar pressão para o filtro para evitar a transferência de fibrina dentro do saco. Após filtração, selar o tubo e retirar o saco (siga o fabriorientações do fabri- para preparação de ligado de plaquetas). Conecte uma linha dedicada ao soro saco e transferência final em tubos de 50 ml sob uma bancada de fluxo laminar para evitar a contaminação microbiana. Tomar uma amostra com uma seringa para testar a ausência de fibrinogénio e executar um teste de esterilidade para culturas de bactérias aeróbicas e anaeróbicas 17. Rotular os tubos de forma apropriada e congelá-los a – 20 ° C até o uso. 4. Preparação do meio de expansão Preparar 500 ml de meio de proliferação completa. Para Dulbecco Modified Eagle Médium – baixo teor de glucose (DMEM-LG), adicionar 10% de soro autólogo (obtida tal como descrito no ponto 3), glutamina 2 mM, solução de antibiótico a 1% e solução antimicótico a 1%. Esterilizada por filtro no meio de proliferação completa. 5. Isolamento de hMSCs da medula óssea Transfira a amostra de medula óssea (5 – 10 ml) da seringa para uma mL cónico 50 TUser e diluir com solução salina estéril (razão 1: 4). Vortex do tubo de 50 mL durante 30 s para desagregar os aglomerados de células. Aquecer o gradiente de densidade (densidade de 1,077 g / L; ver Tabela de Materiais) para a TA antes de utilização e a camada de medula óssea diluída cuidadosamente (para evitar a mistura de ambas as camadas) sobre o gradiente de densidade por adição de 20 ml de amostra a 15 ml de densidade gradiente para cada tubo de 50 ml (Figura 2A). Centrifuga-se a 400 x g sem travão, a 25 ° C durante 30 min, depois de recolher a fracção mononuclear na interface líquido-líquido e transferi-lo para um novo tubo de 50 ml usando uma pipeta de 5 ml estéril. Lava-se a fracção mononuclear reunidos duas vezes com meio completo a proliferação e centrifugar os tubos a 400 × g durante 10 min a 25 ° C para se obter os sedimentos celulares. Descartar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente cada pelete de células em 5 ml de meio de proliferação completa. Dilui-se a uma proporção de 1: 100 para contagem das células. Contar as células utilizando um hemocitómetro, após uma diluição de 1: 1 com coloração com azul de tripano para avaliar a viabilidade celular. 6. Cultura de hMSCs na Presença de autólogo Serum Encha dois ou mais frascos (TC) cm2 de cultura de tecido com 75 15 mL de meio completo fresco proliferação e transferi-los para uma incubadora de cultura de células a 37 ° C e 5% de CO2, até utilização. semente 0,3   – 0,5 x 10 6 células / cm2 (37,5 x 10 6 células / 15 ml de meio completo fresco proliferação) e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 48 h. Ao mesmo tempo, as sementes 1 x 10 6 células em um balão de 2 25 centímetros TC com 5 ml de meio completo fresco de proliferação Unidade Formando o Colony – fibroblastos (CFU-M) ensaio. Cultura para 2 semanas (continua na seção 12). Descarte a médio e lavar cuidadosamente os frascos do passo 6.2 com meio de proliferação completa para remove células não aderentes e detritos. Adicionar meio fresco aos frascos e substituir metade do que duas vezes por semana, até 70-80% de confluência (cultura primária, da passagem 0 (P0)) (Figura 2B). Recuperar as células, utilizando uma protease específica livre animal recombinante (ver tabela de materiais; utilize 3 mL de solução por frasco, tal como recomendado pelo fabricante) e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 10 min. Adicionar 6 mL de meio de proliferação completa por frasco e recolher em um tubo de 50 mL. Repita o passo 5.6. NOTA: IMPORTANTE: O uso desta protease em vez de tripsina permite a recuperação de algumas células mesodermal progenitores (PPM) presentes na cultura, que é de tripsina resistentes. Para uma maior expansão, replate a suspensão de células a 2000 – 3000 células / cm2 em novas 75 centímetros 2 frascos TC (P1) (Figura 2C). Utilizar alíquotas de células para avaliar o potencial de diferenciação das MSCsno sentido osteogênico, adipogênica e linhagens condrogênicas. Realizar ensaios de diferenciação seguintes recomendações do fabricante (Figura 2D). NOTA: Diferente métodos de coloração pode ser usada para avaliar a diferenciação multilinhagens. 7. Preparação de um meio osteogênico com suplementos farmacêuticos Dilui-se uma solução de ácido ascórbico (solução 1A:. Ácido ascórbico a 200 mg / mL (ver o quadro de Materiais) a 1:10 com DMEM-LG, para se obter uma solução 20 mg / ml (solução de 1B, a solução de trabalho) aliquotas de Stock de soluções e 1A 1B a -20 ° C até utilização. Ressuspender 1 g de hidrocortisona em 10 ml de água estéril (solução 2A: hidrocortisona 100 mg / mL (ver o quadro de Materiais) Solução diluída de 2A a 1:. 1000 com DMEM-LG para se obter uma solução / ml 100 ug (Solução 2B, trabalhando solução). aliquotas de soluções de Stock 2A e 2B, a -20 ° C até utilização. Mediante o uso de prepare meio fresco osteogénica como se segue: adicionar DMEM-LG com 10% de soro autólogo, 50? g de ácido ascórbico / mL e 0,4 ug / ml de hidrocortisona. Estéril-filtro do meio osteogênico. 8. Osteogénica pré-indução e recuperação de hMSCs Remover completamente o meio de proliferação e adicionar osteogénicas médias 96 h antes da colheita das células (isto é, 80 – 90% de confluência está geralmente alcançado em 7 d). Fornecer uma osteogênico mudança de meio adicional de 24 h antes da colheita das células. Separe as células tal como descrito no passo 6.5 e suavemente ressuspender o sedimento de adição de 2 mL de meio de proliferação completa em um tubo de 50 mL. NOTA: A viabilidade das células pode ser reduzida (cerca de 10%) como um resultado de osteoindução. agregados celulares podem ser observados. Após a contagem, lavar as células com meio completo a proliferação e centrifugar a 300 x g durante 5 min. Ressuspender o sedimento suavemente a 1-2 x 10 6 células viáveis / 2mL de plasma autólogo (ver secção 2) por tubo de 50 mL. 9. Preparação de hMSC / coágulo de fibrina Constructos Adicionar 150 ul de gluconato de cálcio a 100 mg / ml a cada tubo 50 mL obtido no passo 8.3. e voltar a suspender as células sob agitação suave. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 15 – 30 minutos para se obter hMSC / fibrina construções coágulo (Figura 3A). Prepara-se uma construção de coágulo de fibrina sem células para ser utilizada como um controlo. NOTA: IMPORTANTE: É recomendável para preparar este coágulo de controle de pelo menos 2 h antes do ensaio de viabilidade celular, que leva 30 minutos ou mais para reticular. 10. Célula ensaio de viabilidade Retirar o líquido dos tubos de 50 ml e adicionar 1 mL de meio de proliferação completo contendo 10% de reagente / viabilidade celular v v (AB; consulte a Tabela de Materiais), de acordo com as orientações do fabricante. incubar the tubos a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 3 h. Medir a absorvância a 570 nm com um comprimento de onda de referência de 600 nm (AB no tempo 0; T0). Descartar o sobrenadante e adicionar 2 mL de meio de proliferação completo fresco. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 O / N. No dia seguinte (AB em tempo de 24 h; t24), repita os passos 10,1-10,3 (Figura 3B). 11. histológica avaliação da viabilidade celular e deposição de cálcio no interior do coágulo de fibrina Construções Fixar os / fibrina construções coágulo hMSC em 4% w / v neutra tamponizada de formalina O / N a 4 ° C. Lavar 4x em D-PBS durante 15 min e armazenar em 70% de etanol. Desidratar as amostras a 40 ° C numa série de etanol graduada: 80%, uma vez durante 30 min, 95% duas vezes durante 45 min e 3 x 100% durante 1 h. Esclarecer duas vezes em xilol durante 45 minutos a 40 ° C. Lavar as amostras em parafina líquida a 60 ° C durante 2 h e incorporá-los. Corte o bloco de parafina com um micrótomo e montar tele secções (5 uM) em lâminas de vidro. Manchar as seções desparafinados usando o Eosina (H & E) método (Figura 3C) Hematoxilina padrão e. Realização da coloração de von Kossa por tratamento das secções com 1% de nitrato de prata durante 15 minutos, 0,5% Pirogalol durante 2 min, e 5% de tiossulfato de sódio durante 2 min. Contracoloração das secções com 0,1% de vermelho rápido nuclear diluído em uma solução de sulfato de alumínio contendo 5 g durante 5 min e lavá-los com água potável durante 5 min. Montar as seções com um agente de montagem. Avaliar a deposição mineral na forma de grânulos pretos sob microscópio de luz (aumento de 400X) (Figura 3D). 12. Ensaio CFU-F Lavar o frasco de 25 cm2 (a partir do passo 6.3.) Com D-PBS. Mancha utilizando o método de May-Grunwald / Giemsa padrão. Visualmente quantificar o número hMSC marcando colónias individuais (Figura 4) sob um microscópio de luz. NOTA: Sea medula óssea é tomado como no passo 1.2. e as seções 2-9 são realizados em Boas Práticas de Fabricação (BPF), com a aprovação regulamentar necessário, os HMSC / fibrina construções coágulo pode ser implantado para aplicações ortopédicas.