תרבות משלוח Cell mesenchymal סטרומה ב עצמי תנאים: גישה חכמה עבור יישומים אורתופדיות

הפרוטוקול הנוכחי פותח בהתאם להצהרה של ההסתדרות הרפואית העולמית של הלסינקי בנוגע להתנהלות האתית של בני אדם היה מעורב במחקר. זה אושר על ידי ועדת האתיקה של Azienda Ospedaliero-Universitaria פיזאנה. הערה: מח עצם התקבל בחולים העוברים ניתוח החלפת מפרק ירך הכולל שיגרתי (לפי צעד 1.1) 15; פלזמה לעריכת הקריש הושגה מדם היקפי עצמי 13; סרום אוטולוגי, כתוספת עבור מדיום התרבות, נאסף מתוך apheresis כל-דם עצמי. כל המטופלים קיבלו מידע מפורט על הליך וחתם על טופס הסכמה בכתב. 1. איסוף מדגם מח עצם אסוף מח עצם מהתעלה מדולר הירך לאחר ניתוח החלפת מפרק ירך (עבור מחקרים). בקצרה, במהלך תקופת ההכנה כירורגית של תעלה מהדולרית כדי hOuse הגבעול התותב, לאסוף את הדם במח העולה על גדותיה (כ 10 – 15 מיליליטר, תלוי בגודל התותב) 15. אוֹ אסוף לשאוב מח עצם מפסגת הכסל בהרדמה מקומית, בעקבות הליך המטולוגיות סטנדרטי על 20 – 30 ד מראש (עבור יישומים קליניים) 16. הערה: בשני המקרים heparinized מזרקים (כדי למנוע היווצרות קריש) יש להשתמש לצורך התאוששות מח עצם. 2. הכנת פלזמה עצמית אסוף 20 מיליליטר של דם היקפי ממטופל צינורות איסוף דם ואקום המכילים EDTA K3 (5.4 מ"ג ב 3 צינורות מיליליטר) ו צנטריפוגות ב 2,400 × גרם במשך 15 דקות. לשאוב את רכיב פלזמה בתוך שפופרת 15 מ"ל ו ההקפאה ב -20 ° C עד השימוש. 3. הכנה של הסרום העצמי מעביר את יחידת הפלזמה לתוך שקית העברה באמצעות ספייק. ניתק את התיק המלא על ידי ריתוך weigh את השקית כדי לחשב את הנפח של הפלזמה (איור 1 א). להקריש הפלזמה העצמית על ידי הזרקת גלוקונאט סידן 100 מ"ג / מיליליטר ב 10% w / v דרך מחבר היציאה (האיור 1B). לאחר ערבוב את התיק, למקם אותו על 4 מעלות CO / N בלי ללחוץ כדי להקל היווצרות קריש דם. צנטריפוגה השקית 4,900 גרם × במשך 15 דקות ב RT. קח את הדלי צנטריפוגות מתוך צנטריפוגה ולהסיר את השקית בזהירות (פעל על פי ההנחיות של היצרן לעריכת lysate טסיות) (תרשים 1C). לבודד את הקריש בדיוק מעל המהדק כדי להקל סינון. חבר את ערכת הסינון לשקית ההעברה באמצעות ספייק להציב לתוך פתח היציאה של ערכת הסינון. לתלות את התיק ופתח את המהדק הכחול כדי לאפשר את הזרימה בסרום על ידי כוח הכביד. אל תפעילו לחץ על מסנן כדי למנוע העברה של הפיברין לשקית. לאחר סינון, לאטום את הצינורות ולהסיר את השקית (יש לעקוב אחר התעשייהההנחיות של turer להכנת lysate טסיות). חבר קו ייעודי אל בסרום השקית והעברה הסופי לתוך צינורות 50 מיליליטר תחת ספסל זרימה למינרית כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי. לקחת דגימה עם מזרק כדי לבדוק בהעדר פיברינוגן ולבצע בדיקת סטריליות עבור תרביות חיידקים אירוביים ואנאירוביים 17. לייבל הצינורות כראוי ולהקפיא אותם – 20 ° C עד השימוש. 4. הכנה הבינונית הרחב כן 500 מיליליטר של מדיום התפשטות מלא. כדי בינוני הנשר שונה של Dulbecco – גלוקוז נמוך (DMEM-LG), להוסיף 10% בסרום אוטולוגי (שהושגו כמפורט בסעיף 3), 2 מ"מ גלוטמין, 1% פתרון אנטיביוטיקה 1% פתרון antimycotic. מסנן סטרילי מדיום התפשטות המלא. בידוד 5. hMSCs ממח העצם העבר בדגימת מוח העצם (5 – 10 מ"ל) מן המזרק לתוך חרוטי 50 מ"ל tuלהיות לדלל אותו עם מי מלח סטרילית (יחס 1: 4). וורטקס הצינור 50 מ"ל במשך 30 s ל disaggregate אשכולות התא. מומלץ לחמם את שיפוע צפיפות (L / 1.077 גרם צפיפות; ראו טבלה של חומרים) כדי RT לפני השימוש בשכבה במח העצם בדילול בעדינות (כדי למנוע ערבוב שתי שכבות) על שיפוע צפיפות על ידי הוספת 20 מ"ל של המדגם ל -15 מ"ל של צפיפות שיפוע לכל (איור 2 א) 50 צינור מ"ל. צנטריפוגה ב g 400 × ללא הבלם של 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן לאסוף את השבר mononuclear בממשק נוזל-נוזל ולהעביר אותו צינור חדש 50 מ"ל בעזרת פיפטה 5 מ"ל סטרילי. שטוף את החלק יחסי mononuclear שנאסף פעמים עם מדיום התפשטות מלא צנטריפוגות הצינורות ב g 400 × 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס להשיג כדורי תא. בטל supernatant בעדינות resuspend כל גלולה תא 5 מ"ל של מדיום הפצת מלאה. לדלל ביחס של 1: יחס 100 עבור ספירת תאים. ספירת התאים באמצעות hemocytometer לאחר דילול 1: 1 עם מכתים Trypan כחול להעריך כדאיות התא. 6. תרבות של hMSCs בנוכחות סרום עצמי מלאו שתיים או יותר 75 ס"מ 2 רקמות תרבות (TC) צלוחיות עם 15 מ"ל של מדיום הפצת שלם טרי ולהעבירם חממה תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד השימוש. זרע 0.3   – 0.5 x 10 6 תאים / 2 ס"מ (37.5 x 10 6 תאים / 15 מ"ל של מדיום הפצת שלם טרי) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 48 שעות. במקביל, זרע 1 x 10 6 תאים בבקבוק 25 ס"מ 2 TC עם 5 מ"ל של מדיום הפצת שלם טרי עבור יחידת המושבה להרכיב – פיברובלסטים (CFU-F) assay. תרבות 2 שבועות (המשך יבוא בסעיף 12). מחק את בינוניים לשטוף בעדינות את צלוחיות משלב 6.2 עם מדיום התפשטות מלא remove תאים ופסולת nonadherent. הוסף בינוני טרי הצלוחיות ולהחליף חצי ממנו פעמים בשבוע, עד 70 – 80% confluency (תרבות העיקרית, מעבר 0 (P0)) (איור 2 ב). לשחזר את התאים באמצעות פרוטאז בחינם חיה ספציפית רקומביננטי (ראו טבלה של חומרים; להשתמש 3 מ"ל של הפתרון לכל בקבוק כפי המומלץ על ידי היצרן) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 10 דקות. הוסף 6 מ"ל של מדיום התפשטות מלאה לכל בקבוק ולאסוף בצינור אחד 50 מ"ל. חזור על שלב 5.6. הערה: חשוב: השימוש פרוטאז זה במקום טריפסין מאפשרת התאוששות של כמה תאים mesodermal אבות (MPCs) נוכחים בתרבות, אשר טריפסין עמיד. להתרחבות נוספת, replate ההשעיה התא 2,000 – 3,000 תאים / 2 ס"מ ב 75 ס"מ 2 TC צלוחיות חדש (P1) (איור 2 ג). השתמש aliquots של תאים כדי להעריך את פוטנציאל הבידול של MSCsלקראת osteogenic, adipogenic שושלות chondrogenic. לבצע מבחני בידול בעקבות המלצות היצרן (איור 2 ד). הערה: שיטות מכתימות שונה שניתן להשתמש בם כדי להעריך בידול multilineage. הכנת 7. של בינוני osteogenic עם תוספי התרופות לדלל פתרון חומצה אסקורבית (פתרון 1A:. חומצה אסקורבית 200 מ"ג / מ"ל (ראו טבלה של חומרים) 1:10 עם DMEM-LG, כדי להשיג פתרון 20 מ"ג / מ"ל (פתרון 1B, הפתרון עובד) aliquots מאגר של פתרונות 1A ו 1B ב -20 ° C עד השימוש. הידרוקורטיזון גלולה 1 גרם ב 10 מ"ל של מים סטריליים (פתרון 2A: הידרוקורטיזון 100 מ"ג / מ"ל (ראו טבלה של חומרים) מדוללת 2A 1:. 1,000 עם DMEM-LG כדי להשיג פתרון 100 מיקרוגרם / מ"ל (פתרון 2B, עובד פתרון). aliquots מאגר של פתרונות 2 א ו -2 ב -20 ° C עד השימוש. עם השימוש prepare בינוני osteogenic טריים כדלקמן: להוסיף DMEM-LG עם 10% בסרום אוטולוגי, 50 חומצה אסקורבית מיקרוגרם / מ"ל ​​ו הידרוקורטיזון 0.4 מיקרוגרם / מ"ל. סטרילי-מסנן המדיום osteogenic. 8. osteogenic טרום אינדוקציה ושחזור של hMSCs להסיר לחלוטין את מדיום ההתפשטות ולהוסיף 96 שעות בינוניות osteogenic לפני קטיף תא (כלומר, 80 – 90 מפגש% בדרך כלל הוא הגיע ב -7 ד). לספק שינוי בינוני osteogenic נוסף 24 שעות לפני קטיף תא. לנתק את התאים כמתואר בשלב 6.5 בעדינות resuspend גלולה הוספת 2 מ"ל של מדיום התפשטות מלאה בתוך שפופרת 50 מ"ל. הערה: כדאיות התא עשוי להיות מופחת (כ -10%) כתוצאה osteoinduction. ניתן לצפות אגרגטים הסלולר. לאחר ספירה, לשטוף את התאים עם מדיום התפשטות מלא צנטריפוגות ב 300 × גרם במשך 5 דקות. Resuspend גלולה בעדינות ל 1 – 2 x 10 6 תאים קיימא / 2מיליליטר של פלזמה עצמית (ראה סעיף 2) לכל 50 צינור מיליליטר. הכנת 9. hMSC / הפיברין קריש בונה להוסיף 150 μl של gluconate סידן ב 100 מ"ג / מ"ל ​​על צינור אחד 50 מ"ל המתקבל צעד 8.3. ו resuspend התאים תחת רעד עדין. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 במשך 15 – 30 דקות כדי להשיג בונת קריש hMSC / הפיברין (איור 3 א). כן מבנה קריש הפיברין ללא תאים לשמש כביקורת. הערה: חשוב: זה recommendable להכין קריש שליטה זו לפחות 2 שעות לפני assay כדאיות התא, כפי שהוא לוקח 30 דקות או יותר כדי crosslink. Assay כדאיות התא 10. הסר את הנוזל מתוך 50 צינורות מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום התפשטות מלאה המכילה מגיב כדאיות התא 10% v / v (AB; ראו טבלה של חומרים), על פי הנחיות היצרן. דגירת הצינורות דואר ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 3 שעות. מדוד את הספיגה ב 570 ננומטר עם אורך גל ייחוס של 600 ננומטר (AB בזמן 0; t0). בטל supernatant ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום הפצת שלם טרי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 O / N. למחרת (AB בשלב 24 שעות; T24), חזור על שלבים 10.1 כדי 10.3 (איור 3 ב). הערכת היסטולוגיים 11. של כדאיות התא הפקדת סידן בתוך בונה קריש פיברין תקן את בונה קריש hMSC / הפיברין 4% w / v O נייטרלי שנאגרו פורמלין / N ב 4 ° C. 4x לשטוף D-PBS במשך 15 דקות ולאחסן באתנול 70%. מייבשים את הדגימות ב 40 ° C בסדרה של אתנול מדורג: 80% פעם למשך 30 דקות, 95% פעמים במשך 45 דקות ו 3x 100% במשך 1 שעה. להבהיר פעמים קסילן במשך 45 דקות ב 40 מעלות צלזיוס. שוטפים את דגימות פרפין נוזלי ב 60 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות והטמיעו אותם. חותכים את גוש פרפין עם microtome ו הר tהוא סעיפים (5 מיקרומטר) על שקופיות זכוכית. כתם בסעיפי deparaffinized באמצעות Hematoxylin הסטנדרטי Eosin (H & E) שיטה (איור 3 ג). בצע מכתים פון Kossa ידי טיפול קטעים עם 1 כסף חנקתי% במשך 15 דקות, 0.5% Pyrogallol למשך 2 דקות, ו thiosulfate נתרן 5% למשך 2 דקות. Counterstain את החלקים עם אדום מהיר גרעיני 0.1% בדילול בתמיסה המכילה אלומיניום סולפט 5 גרם במשך 5 דקות ולשטוף אותם במי ברז במשך 5 דקות. הר החלק עם סוכן גובר. להעריך את בתצהיר מינרליים כמו גרגירים שחורים תחת מיקרוסקופ אור (הגדלה 400X) (איור 3D). 12. Assay CFU-F לשטוף את הבקבוק 25 ס"מ 2 (משלב 6.3.) עם D-PBS. כתם על ידי שימוש בשיטת מאי-גרינוולד / Giemsa הסטנדרטי. ראייה לכמת מספר hMSC כשקלע מושבות בודדות (איור 4) תחת מיקרוסקופ אור. הערה: אםמח העצם נלקח כמו בשלב 1.2. ואת סעיפים 2 – 9 הם ביצעו ב Good Manufacturing Practice (GMP) עם קבלת כל האישורים הרגולטוריים הנדרשים, המבנים קריש hMSC / הפיברין יכול להיות מושתל עבור יישומים אורתופדיות.