Thermostabilisation, Expression, purification et cristallisation du Serotonin Human Transporter Bound to<em> S</em> -citalopram

1. Transfection de Adhérent HEK293S GnTI – Cellules pour écran Thermostabilité Préparer la poly-D-lysine (PDL) doté d'un revêtement de plaques à 96 puits. Effectuer tous les travaux dans une hotte à flux laminaire stérile. Filtrer une solution à 25 pg / ml de page (PDL), le poids moléculaire 70,000-150,000 Da, en utilisant un filtre stérile de 0,2 pm. Ajouter 50 ul de PDL à chaque puits d'une plaque de culture tissulaire à 96 puits (TC), assurant ainsi le fond est uniformément revêtue et incuber à température ambiante pendant 30 min. solution Aspirer PDL et laver avec 200 pi d'eau stérile. Laisser la plaque sécher à l'air pendant 2 h avant le stockage à 4 ° C. des plaques revêtues PDL peuvent être stockés à 4 ° C pendant plusieurs semaines. Trypsinisation des cellules adhérentes HEK293S. Cultiver HEK293S à 80% de confluence dans une boîte de 10 cm maintenue à 37 ° C avec 8% de CO 2. Une seule boîte de 10 cm devrait avoir environ 10 millions de cellules HEK293S. Ne pas utiliser des cellules après 30 passages! </li> Aspirer le milieu et on lave avec 5 ml de tampon phosphate salin (PBS). Ajouter 1 ml de solution de trypsine-EDTA (0,25% de trypsine, 0,02% d'EDTA) aux cellules et on incube pendant 2 min à 37 ° C. Ajouter 10 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et de remettre les cellules par pipetage de haut en bas plusieurs fois à l'aide d'une pipette sérologique. Pipette 10 pi de cellules et mélanger avec 10 pi de solution de bleu trypan (0,4%). Déterminer la densité des cellules en utilisant un hémocytomètre et un microscope optique. Ne pas compter les cellules qui sont colorées bleu comme ils sont morts. Faire en sorte que la viabilité des cellules est supérieure à 90%. Remettre en suspension à fond trypsinisées HEK293S GnTI – les cellules dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS à une densité de 0,5 x 10 6 cellules / mL dans un réservoir de pipette jetable. Environ 5 millions de cellules HEK293S seront nécessaires pour chaque plaque. Un total de 24 constructions peuvent être transfectées sur chaque plaque à l'aide de cette protocole. À l'aide d'une pipette multicanaux, ajouter 100 pi de cellules à chaque puits d'une plaque revêtue PDL. Resuspendre les cellules dans le réservoir après le remplissage de la pipette chaque plaque pour assurer une distribution uniforme des cellules. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° avec 8% de CO 2. Après 24 h, les cellules devraient atteindre environ 80% de confluence. 1 h avant la transfection remplacer les médias. Préparer des complexes ADN-réactif de transfection pour la transfection. Pour chaque construction en arrière – plan SERT TC à cribler, mélanger 450 ng d' ADN avec 45 pi de DMEM sans sérum et mélanger. Ajouter 1,6 ul du réactif de transfection à 45 pi de DMEM sans sérum et mélanger. Immédiatement ajouter la solution diluée de réactif de transfection à la solution d'ADN et mélanger. Ne pas mélanger les solutions dans l'ordre inverse. Attendez de 10 – 15 min et ajouter 20 pi de mélange réactif / transfection d'ADN à 4 puits. Une fois que tous les puits ont été transfectées, mélanger la plaque en basculant doucement unnd avant et revenir à la 37 ° C incubateur. Après 16 – 24 h remplacent les médias avec DMEM contenant du sérum et de butyrate de sodium à 10 mM. Environ 48 h après la transfection supprimer les médias et soit procéder immédiatement à thermostabilité écran ou congeler les cellules à -80 ° C pour être utilisé plus tard. Les cellules peuvent être stockées à -80 ° C pendant plusieurs semaines. Écran Thermostabilité basé à proximité 2. Scintillation avec S -citalopram Incuber les cellules avec le -citalopram de 200 nM dans 25 pi de TBS (Tris Buffered Saline – Tris 20 mM, pH 8, NaCl 100 mM) pendant 5 min à température ambiante. Solubiliser les cellules en ajoutant 25 pi d'mM n-dodécyl-β-D-maltopyranoside 8 (C12M), 1 mM de cholestéryle hemmisuccinate (SCH), cocktail inhibiteur de protease (fluorure de phénylméthanesulfonyle 2 mM (PMSF), 0,1 mg / ml d'aprotinine, 4 g / ml de pepstatine A, et 4 ug / ml de leupeptine) dans du TBS, et incubation pendant 1 h à température ambiante. Ajouter 50 pi de TBS wie 20 nM [3 H] citalopram (81,7 Ci / mmol), 0,1% de sérum albumine bovine, et 2 mg / mL His-tag affinité scintillation de proximité (SPA) perles à trois puits pour chaque construction. Pour le dernier puits ajouter la même liste, mais solution compléter avec 100 uM sertraline pour déterminer la liaison non spécifique. Veiller à ce que les perles His-tag affinité SPA sont bien mélangés lors de l'ajout à la plaque de 96 puits. Mesurer la liaison [3 H] citalopram en utilisant un 96 puits compteur à scintillation à température ambiante avec un temps de comptage 1 min par puits. Continuer plaques de comptage jusqu'à ce que le compte total Plateau (après environ 36 h). plaques thermiques pour 15 min dans un bloc de chauffage avec un couvercle chauffé à 33 ° C. Mesurer la liaison à nouveau après le chauffage [3 H] citalopram comme décrit dans 2.4. Répétez l'étape 02.04 à 02.05 et de modifier l'étape de chauffage à 36 ° C, 39 ° C, 45 ° C, 48 ° C et 51 ° C. Régler la température de chauffage en fonction de la température de fusion apparente (Tm)de la protéine cible et la stabilité thermique de la construction la plus stable. Continuer à chauffer les plaques jusqu'à ce que toutes les constructions ont une faible numération spécifiques. Analyser les données pour déterminer les valeurs Tm. Déterminer le total des comptes moyens par minute (CPM) de chaque construction pour les puits qui ne contiennent pas sertraline en faisant la moyenne des 3 puits réplicats. Déterminer le CPM non spécifique en faisant la moyenne du CPM de chaque puits contenant sertraline dans une seule plaque. Calculer CPM spécifique en soustrayant le CPM non spécifique de la CPM totale. Calculer la Tm par un ajustement non linéaire à une fonction sigmoïde de Boltzmann. Constructs avec une faible CPM spécifique à la température ambiante (<10% du WT) ne disposent généralement pas des valeurs précises Tm. Les mutations de la plupart des constructions thermostables peuvent être combinés ensemble et criblés pour additifs augmente en thermostabilité. 3. Expression du Transporter Serotonin humain dans HEK293S GnTI <sup> – Cellules Transformer des cellules DH10Bac chimiquement compétentes avec 1 ng de plasmide. Ajouter le plasmide à 50 ul de cellules DH10Bac et laisser incuber sur de la glace pendant 30 minutes. choc thermique des cellules DH10Bac à 42 ° C pendant 30 sec. Ajouter 200 ul de milieu SOC et incuber à 37 ° C pendant 4 heures sous agitation. Plaque toutes les bactéries sur une plaque de milieu Luria Broth (LB) contenant 50 pg / ml de kanamycine, 7 ng / ml de gentamicine, 10 pg / ml de tetracycline, 100 ug / ml de 5-bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside, et 40 pg / ml isopropyl β-D-thiogalactopyranoside 1 (IPTG). Isolât lacZ – colonies (colonies blanches) cultivées à 37 ° C pendant 2 jours sur des plaques d'agar LB. Cultiver plusieurs colonies O / N à 37 ° C dans 5 ml de LB contenant des antibiotiques et d'isoler l'ADN bacmid. Isoler les bactéries à 1000 xg dans une centrifugeuse pendant 5 min. surnageant Jeter. Remettre en suspension les bactéries avec 200 pi de miniprep run tampon de esuspension. Lyser les bactéries par addition de 200 ul de tampon de lyse miniprep et en inversant doucement le tube 10 fois. Ajouter 200 pi de tampon de neutralisation. Éliminer la fraction insoluble par centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min dans une centrifugeuse. Ajouter 1 ml d'isopropanol surnageant et réfrigérer à -20 ° C pendant 20 min pour précipiter l'ADN. Spin à 14.000 xg pendant 15 min dans une centrifugeuse et éliminer le surnageant. Laver culot d'ADN avec 70% EtOH et tourner à nouveau à 14 000 xg pendant 15 min. surnageant Jeter. Air ADN sec jusqu'à ce que tous les EtOH a évaporée et remettre en suspension dans 50 ul d'eau. REMARQUE: Bacmid ADN doit être transfecté dans des cellules Sf9 immédiatement pour obtenir les meilleurs résultats, mais peut également être conservé à -20 ° C pendant plusieurs semaines. Transfecter Bacmid ADN dans 1×10 6 cellules adhérentes Sf9 cultivées dans une chambre humidifiée à 27 ° C dans un plat à 6 puits. Effectuer toutes les manipulations de culture cellulaire dans une hotte à flux laminaire stérile. <li> Supprimer les médias à partir de cellules et ajouter 2 ml de milieu Sf9 frais. Ajouter 5 ug d'ADN de bacmide à 100 ul de milieux Sf9 (solution A). Ajouter 8 ul d'un Sf9 réactif de transfection lipide cationique-100 ul de milieux Sf9 (solution B). Incuber tube contenant la solution B pendant 5 min. Mélanger le tube contenant la solution A avec la solution B et on incube à température ambiante pendant 30 minutes et ajouter la totalité de la solution pour les cellules Sf9. Au bout de 96 heures, la récolte du surnageant (virus P1) en faisant passer à travers un filtre de 0,2 um. Le virus P1 peut être stocké pendant plusieurs mois à 4 ° C dans l'obscurité et réutilisée pour rendre le virus P2 selon les besoins. Ajouter 100 ul de virus P1 à 1 L de cellules Sf9 à une densité de 1 x 10 6 cellules / ml dans des milieux Sf9. Infect cellules pendant 96 h, de plus en plus à 27 ° C sur un agitateur à 100 tours par minute. Centrifuger les cellules dans une centrifugeuse à 4000 g pendant 15 min et le surnageant de filtre contenant des particules de virus à travers un filtre de 0,2 um. Jeter les culots cellulaires. Détermdensité virale ine en utilisant un dosage de plaque virale ou d'un compteur de virus. La densité de virus doit être des particules> 1 x 10 8 de virus par millilitre. le virus P2 peut être stocké à 4 ° C dans l'obscurité et utilisé pendant plusieurs mois. Infectent 10 L de HEK293S GnTI – 7 cellules de culture en suspension à 37 ° C avec 8% de CO 2 et 85% d' humidité sur un agitateur à 130 tpm dans 293 supports d'expression supplémenté avec 2% de FBS à une multiplicité d'infection (MOI) de 2 et une densité de 3 x 10 6 cellules / ml, typiquement de 30 – 50 ml de virus P2 par 800 ml de cellules dans un flacon de 2 L dérouté. NOTE: Il est recommandé de ne pas utiliser plus de 80 ml de virus P2 depuis le HEK293S GnTI – cellules vont croître lentement et peut devenir non viable en raison d'un changement de pH. Sf9 médias est plus acide que les médias 293 d'expression. 12-16 h post-infection, ajouter le butyrate de sodium à une concentration de 10 mM d'un stock 1 M. 48 – 60 h post-infection, les cellules de récolte par centrifugation à4000 g pendant 15 min. Retirer le surnageant. Resuspendre les cellules dans 150 ml de TBS, 2 uM S -citalopram ou d' autres inhibiteurs de la SERT et conserver à -80 ° C jusqu'au moment de la purification. 4. Affinity Purification de la Serotonin Transporter de l'immunisation et Cristallisation Décongeler les cellules de 10 L de la culture dans l'eau chaude (environ 30 ° C) et resuspendre en passant rapidement à travers une pipette de 10 ml jusqu'à homogénéité. Préparer une solution de détergent pour la solubilisation (150 ml): 80 mM de Tris, pH 8, NaCl 150 mM contenant 40 mM C12M mM, CHS 5 et cocktail inhibiteur de protease. Ajouter toutes les cellules dans un bêcher avec un barreau d'agitation et d'ajouter toute la solution de détergent pour les cellules tout en agitant. Solubiliser à 4 ° C pendant 1 h sous agitation. Spin lysat à 8000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Jeter culot et surnageant décanter dans des tubes d'ultracentrifugation propres. Spin à 100.000 xg pendant 1 h dans un ultracentrifuge. Jeter pastille et filtre surnageant à travers un filtre de 0,2 um. Passer au- dessus de lysat ml de Strep résine 10 d'affinité dans une colonne à l' aide d' une pompe péristaltique équilibrée dans un tampon de lavage: 1 mM C12M mM , CHS 0,2, 5% de glycerol, 25 uM de lipide (1-palmitoyl-2-oléoyl – sn -glycero- 3-phosphocholine, 1-palmitoyl-2-oléoyl – sn – glycéro-3-phosphoéthanolamine et de 1-palmitoyl-2-oléoyl – sn – glycéro-3-phosphoglycérol à un rapport molaire de 1: 1: 1) et 1 iM de la -citalopram ou ISRS dans TBS. Raccorder la colonne d'affinité Strep à un système liquide rapide des protéines Chromatographie (FPLC) et colonne de lavage à 2 mL / min avec 66 ml (volumes 6.6 de colonne) de tampon de lavage. Éluer la protéine purifiée dans le même tampon additionné de 5 mM desthiobiotine à 0,5 ml / min en utilisant 33 ml (3,3 volumes de colonne) de tampon. Prélever 1 ml fractions; les fractions de pic seront ~ 10 mL. La protéine purifiée peut être conservée à 4 ° C pendant 2 à 3 d, si désiré. NOTE: Le rendement total sera de 3 -4 mg de CC et SERT 1 mg de SERT IC. Une absorbance de 2 UA à 280 nm est égale à 1 mg / ml SERT. 5. Reconstitution du transporteur dans des liposomes pour la vaccination Préparer des liposomes contenant asolectine: cholestérol: lipide A: cerveau lipide polaire (rapport molaire 60: 17: 3: 20). Dissoudre les lipides dans 1 ml de chloroforme et on ajoute 40 mg de lipide total à 100 ml en verre ballon à fond rond à un rapport molaire indiqué. Evaporer le chloroforme pendant au moins 1 h sous vide avec le ballon à fond rond tournant dans l'eau chaude, environ 30 ° C. Réhydrater les lipides en ajoutant 10 mL de TBS. Incuber dans un tampon pendant 10 min. Congeler le lipide en plaçant le ballon dans N2 liquide. Dégel. Immergez fond sphérique du flacon dans un bécher rempli d'eau chaude, d'environ 30 ° C. Traitement par ultrasons dans un bain de sonication pendant 5 min. Vortex et répétez les étapes 5.1.3 – 5.1.4 10 fois ou jusqu'à ce que le lipideest complètement remis en suspension à partir du fond et forme une suspension trouble. Extruder le mélange lipidique ensemble deux fois par 200 filtres nm. Le lipide apparaît sous la forme d'une suspension laiteuse avant l'extrusion; par la suite, il sera translucide. Ne pas ajouter le mélange lipidique entier à l'extrudeuse à la fois comme il peut se boucher, ce qui entraîne la perte de l'échantillon. Spin lipides à 100.000 xg pendant 20 minutes et remettre en suspension dans 0,5 à 1 ml de TBS à une concentration de 40 mg / mL. Concentré purifié SERT IC 250 – 500 ul en utilisant un concentrateur de protéine de 100 kDa MWCO centrifuge à 2 – 4 mg / ml et on sature les liposomes avec 5 mM C12M. Ajouter SERT purifiée au détergent: mélange lipidique dans 1 ml de volume final. Enlever C12M par 3 additions successives de 80 mg / résine d'absorption hydrophobe mL. Pour les 2 premières additions, incuber avec de la résine avec rotation pendant 2 h à 4 ° C. Éliminer la résine par passage à travers de la laine de verre. Effectuer l'incubation finale avec de la résinependant la nuit. Concentrez-protéoliposomes par centrifugation à 100 000 xg pendant 20 min. Jeter le surnageant du culot et remettre en suspension dans 250 – 500 pi de TBS. Ajouter 10 pM concentration finale de S -citalopram à la protéine reconstituée après le retrait final de résine. Solubiliser 2,5 ul des protéoliposomes dans un tampon SDS-PAGE chargement (Tris 62,5 mM, pH 6,8, 10% de glycérol, 2% SDS, 0,01% de bleu de bromophénol, 100 mM de DTT) et sur un gel SDS-PAGE à 200 V pour 1 h pour veiller à ce que le SERT a été reconstitué avec succès. Protéoliposomes peuvent être conservés à -80 ° C en aliquotes pour un stockage à long terme et décongelées sur de la glace avant chaque immunisation. 6. Le dépistage des anticorps reconnaissant des épitopes 3D Écran lignées cellulaires d'hybridome par Western blot. Les anticorps qui reconnaissent par western blot SERT se lient probablement des épitopes linéaires et ne seront probablement pas utiles pour les études structurelles. Mélanger 1 ug de purified SERT IC ou SERT CC et exécuter sur un 4 – gel SDS-PAGE 15% à 200 V pendant 1 h. Transférer à une membrane de nitrocellulose à 200 mA pendant 30 minutes en utilisant un tampon Towbin (Tris 25 mM, glycine 192 mM, 20% (v / v) de methanol, 0,1% de SDS). La membrane peut être séchée et stockée indéfiniment à la température ambiante. Membrane remouillage avec 10% de methanol, et on lave avec du PBS (phosphate 10 mM, pH 7,4, NaCl 137 mM, KCl 2.7). Poulie à 5% de lait en poudre dans du PBS pendant 30 min à température ambiante. Laver avec du PBS et on incube avec 1 pg / ml d'anticorps dans du PBS avec 0,1% de lait. Laver abondamment avec du PBS contenant 0,1% de Tween-20. Laisser incuber avec un anticorps de chèvre anti-souris conjuguée à un colorant IR dilué 1: 10 000 dans du PBS avec 0,1% de Tween 20 et 0,1% de lait. Laver abondamment et numériser en utilisant un système d'imagerie. Mélanger le surnageant d' hybridome contenant des anticorps négatifs occidentaux avec 100 nM de protéine SERT CC en utilisant un rapport molaire de 1: 2 (SERT: mAb) dans 200 pi TBS avec 1 mM C12M, mM CHS 0,2 et 1 uM S -citalopram. Centrifugeuse à 100.000 xg pendant 20 min. Analyser surnageant contenant des complexes SERT-mAb et d' analyser par Fluorescence-détection d' exclusion stérique (FSEC) 8. Jeter le culot. Exécuter 100 pl de surnageant sur une colonne d'exclusion stérique à raison de 0,5 ml / min en utilisant un système de Chromatographie liquide haute performance (HPLC) munie d'un détecteur de fluorescence (excitation: 480 nm, émission: 510 nm) en utilisant un tampon d'essai contenant du TBS, 0,4 mM lauryl néopentylglycol maltose et 1 pM de S -citalopram. Les anticorps qui forment des complexes causeront la protéine GFP-fusion pour éluer plus tôt que le transporteur libre de la colonne d'exclusion de taille. Diluer complexes à 10, 1, 0,1 nM dans 200 ul TBS avec 1 mM C12M, mM CHS 0,2 et 1 uM S -citalopram et relancez FSEC. Les anticorps qui peuvent encore décaler le pic de transporteur à faibles concentrations nanomolaires sontliants de haute affinité et de bons candidats pour des études structurales. Retester liaison par FSEC en présence de 1 mM de sérotonine. Des anticorps qui reconnaissent spécifiquement la conformation liée SSRI ne se lient pas en présence du substrat. Des anticorps qui reconnaissent un epitope 3D qui ne change pas à la suite de la conformation se lient indépendamment du ligand présent. Mélanger les combinaisons de paires différentes d'anticorps et de tester la liaison par FSEC. Les anticorps qui reconnaissent des épitopes distincts causeront SERT pour éluer plus tôt lorsqu'ils sont combinés ensemble par rapport à la liaison d'un anticorps unique. Pour les études structurales initiales, sélectionnez les anticorps les plus élevés d'affinité qui reconnaissent les épitopes 3D. 7. Expression des anticorps Fragment dans les cellules Sf9 des domaines variables et constants clone de Fab par PCR dans le système d'expression d'insecte pour l'expression dans des cellules Sf9 en utilisant des protocoles standards. Transfecter 1 x 10 6 cellules Sf9 avec 5 ug de Bacmid l' ADN codant pour les chaînes légères et lourdes de l'8B6 Fab 8-His avec une séquence de sécrétion GP67 (conformément à la section 3.4). P1 récolte du virus 96 h après transfection et ajouter 500 ul de virus P1 à 1 L de cellules Sf9 à une densité de 1 x 10 6 cellules / ml dans un flacon de 2 litres pour rendre le virus P2. Infect cellules pendant 96 h à 27 ° C. virus récolte P2 (conformément à la section 3.6). 6 L infectent des cellules Sf9 à une densité de 2-3 x 10 6 cellules / ml avec une MOI de 2 avec le virus P2, typiquement de 40 – 50 ml par flacon avec 1 L de cellules Sf9 dans chaque flacon de 2 litres. cellules de récolte environ 96 h de l'infection. Ajouter 50 ml de tampon phosphate pH 8 à une concentration finale de 50 mM pour des cellules et centrifugation à 4000 xg pendant 20 min. Jeter le culot cellulaire et le filtre surnageant à travers une cellule à écoulement tangentiel de 0,2 um filtre. Recueillir le surnageant et conserver à 4 ° C pendant 2 – 3 jours si on le souhaite. <p class="jove_title"> 8. La purification de fragments d'anticorps à partir du surnageant des cellules Sf9 Concentrez surnageant Sf9 en utilisant un 30 kDa de poids moléculaire Cut Off (MWCO) Cellule de flux tangentiel à environ 400-800 ml. Ajouter l'imidazole, pH 8 à une concentration finale de 10 mM et de 10 ml de résine d'affinité His-tag. Incorporer dans un bêcher pendant 1 h à 4 ° C. Collecter His-tag résine d'affinité par centrifugation à 2000 xg pendant 5 min. surnageant Jeter. Emballez résine d'affinité His-tag dans une colonne et se connecter à un FPLC. Laver His-tag résine d'affinité à 2 mL / min avec 66 ml (volumes 6.6 de colonne) de 50 mM de phosphate pH 8, NaCl 150 mM, imidazole 25 mM. Éluer 8B6 Fab dans 33 ml de phosphate 50 mM, pH 8, NaCl 150 mM, imidazole 250 mM. Prélever 1 ml fractions. Diluer purifié par affinité Fab avec un volume de 10 fois de l'acétate 20 mM glacé, pH 5. Fab lier à une colonne d'échange de cations de 1 ml en utilisant une pompe péristaltique à 1 mL / min. Fab séparée en utilisant un 30 mL de lingradient d'oreille de NaCl (0-500 mM) dans 20 mM d'acétate à pH 5,5 en utilisant une FPLC. Fab éluera en un seul pic à ~ 300 mM de NaCl. Analyser sur un gel SDS-PAGE 12,5% en utilisant un tampon d'échantillon contenant du DTT 100 mM. Les chaînes lourdes et légères de la 8B6 Fab se déroulera à 27 et 25 kDa, respectivement, sur un gel SDS-PAGE réducteur. fractions de piscine contenant Fab et se concentrent au moins 10 à 15 mg / ml en utilisant un concentrateur kDa MWCO protéine 30 dans un seau centrifuge oscillant à 3000 x g. Ajuster le pH à 8 par addition de Tris 1 M pH 8 à une concentration finale de 50 mM et stocker Fab purifiés à long terme à 4 ° C. Le rendement total sera de 25 – 30 mg. Une absorbance de 1,4 UA à 280 nm est égale à 1 mg / ml de Fab 8B6. 9. Formation des Complexes et séparation Transporter-anticorps par chromatographie d'exclusion stérique Pour la cristallisation, purifier le SERT CC par chromatographie d'affinité Strep dans C12M comme décrit précédemment (section 4). <li> Digest avec de la thrombine pour supprimer des tags (1: 100 p / p) et EndoH (1:10 p / p) O / N à la température ambiante. On concentre à 250-300 ul en utilisant une protéine kDa MWCO de centrifugeuse concentrateur 100 à une concentration en protéine de 10 mg / ml. Mélanger le SERT concentré avec Fab à un rapport molaire de 1: 1,2, dans un volume inférieur à 500 ul. Centrifuger à 100 000 xg à 4 ° C pendant 20 min. Recueillir le surnageant contenant le complexe SERT-Fab. granulés Jeter. Séparé par Chromatographie d'exclusion stérique (SEC) en utilisant une FPLC sur une colonne d'exclusion de taille équilibrée dans du TBS supplémenté avec 40 mM de n-octyl-β-D-maltoside (C8M) mM, CHS 0,5, 5% de glycerol, 25 uM de lipide (le même que à l' étape 4.5) et 1 uM de S -citalopram à 0,5 mL / min. Collecter des fractions de 0,5 ml et d'analyser le 4 – 15% gels SDS-PAGE, ainsi que par la fluorescence du tryptophane par SEC. GFP étiqueté SERT se déroulera à environ 80 kDa sur un gel SDS-PAGE. Après le retrait des extrémités et des sucres liés à N il fonctionnera comme une protéine de 45 kDa. Determine qui combinent les fractions de mise en commun des seules les fractions qui sont monodisperses à en juger par l'analyse des fractions par fluorescence du tryptophane SEC (Excitation: 280, émission: 335 nm). Magasin purifié complexe SERT-8B6 à 4 ° C pendant 1 semaine. 10. Cristallisation de Transporter-anticorps Complexes de Drop Hanging Avant la cristallisation, on concentre les fractions pics lors de la séparation du complexe SEC SERT-8B6 à 2 mg / ml en utilisant une protéine kDa MWCO de centrifugeuse concentrateur 100. Une absorbance de 2 UA à 280 nm est égale à 1 mg / ml. Ajouter supplémentaires Fab dans un rapport de 1: 0,05 complexe: gratuit Fab. Ajouter 10 uM S libre -Citalopram. Centrifuger à 100 000 xg à 4 ° C pendant 20 min. Collecter surnageant contenant le complexe SERT-Fab. granulés Jeter. Mettre en place un écran de 24 puits goutte suspendue à 4 ° C selon le tableau 1. Cultiver des cristaux de qualité de diffraction sur des solutions de réservoircontenant 100 mM de Tris-NaOH, pH 8,5, 25 – 125 mM de KCl, 32,5 à 34% de PEG 400 et 0,5% d'acide 6-aminohexanoïque. REMARQUE: Utilisez Tris ajusté avec NaOH à pH 8,5 comme tampon. Ne pas utiliser une base Tris ajusté avec HCl. L'écran peut être préparé dans des tubes de 2 ml et utilisé jusqu'à la fin. Prenez soin de la pipette avec précision PEG 400 à l'aide d'une pipette à déplacement positif car il est extrêmement visqueux! Introduire à la pipette 500 ul de chaque solution de réservoir dans un profil bas plaque de 24 puits avec du scellant appliqué à chaque puits. Pipette 1,5, 1,75 et 2 pl du complexe SERT-8B6 sur un 18 mm verre siliconé lamelle. 1 ul d'une solution réservoir au-dessus de l'échantillon de protéine. NOTE: La plaque a été acheté avec du mastic déjà appliqué sur le rebord des puits. Appliquer couvercle coulissant sur le puits 24 avec les gouttes face à la solution de réservoir et sceller immédiatement en appuyant sur lamelle sur mastic pré-appliqué à chaque puits. Continuez jusqu'à ce que tous les 24 puits ont été mis en place. </li> Laissez la plaque finie dans une pièce bien isolée à 4 ° C. Ne pas déranger les plaques pendant au moins 3 jours NOTE: monocristaux apparaîtront dans un délai d'environ 3 jours et atteindre 100-175 pm après 14 jours. Cristaux de récolte en cryoloops et directement clignotera-cool dans un liquide N 2 avant la collecte des données de diffraction des rayons X. Si nécessaire, trouver des conditions de cristallisation supplémentaires par une large sélection avec des gouttes suspendues. Utiliser trois gouttes avec des protéines: les rapports de précipitants 2: 1, 1,5: 1, 1: 1. Si un robot est disponible, puis mis en place 100-150 nL gouttes de plus de 70 pi de solution de réservoir dans une plaque de 96 puits. cristaux 3D plus grands peuvent être cultivées dans 24 puits. Note sur la base de l'apparition de la goutte: 0, claire; 1, de la poussière; 2, précipité granulaire; 3, la séparation des phases; 4 microcristalline; 5, les aiguilles; 6, plaques; 7, les cristaux 3D. Mettre en place la cristallisation par pendaison méthodes de chute dans 24 puits comme décrit ci-dessus autour de cond nouvellement identifiéitions.