Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound<em> S</em> -citalopram

Yapışık HEK293S GnTI 1. Transfeksiyon – Termostabilite Ekranı için hücreler Poli-D-Lisin (PDL) 96 oyuklu plakalar -kaplı hazırlayın. Steril bir laminer akış kaputu tüm çalışmaları gerçekleştirin. 0.2 um steril filtre kullanılarak, bir 25 ug / ml solüsyon (PDL), moleküler ağırlık 70,000-150,000 Da filtre. Alt eşit kaplanır sağlanması, 96-gözlü doku kültür (TC) plakanın her oyuğuna PDL 50 uL ekleyin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Aspire PDL çözeltisi ve steril su, 200 ul ile yıkayın. Veren plakası 4 ° C'de depolanmadan önce 2 saat boyunca kurumasını. PDL kaplı plakalar birkaç hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Yapışkan HEK293S hücreleri, tripsinizasyon. % 8 CO2 ile 37 ° C 'de muhafaza edilen bir 10 cm tabak içinde% 80 konfluansa kadar HEK293S büyütün. Tek bir 10 cm çanak yaklaşık 10 milyon HEK293S hücre olmalıdır. 30 pasajlar sonra hücrelerin kullanmayın! </li> Aspire ortam ve fosfat tamponlu tuz 5 mL (PBS) ile yıkanır. hücrelere Tripsin-EDTA çözeltisi (% 0.25 tripsin,% 0.02 EDTA) 1 ml ilave edilir ve 37 ° C'de 2 dakika süreyle inkübe edin. art arda pipetleme ve serolojik bir pipet kullanarak aşağı% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile tekrar süspansiyon hücreleri ile desteklenmiş Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) 10 ml ekleyin. Pipet 10 hücre uL ve 10 uL tripan Mavi çözeltisi (% 0.4) ile karıştırın. Hemasitometre ve ışık mikroskobu kullanılarak hücre yoğunluğu belirlemek. Onlar öldü mavi lekeli hücreleri saymayın. Bu hücre canlılığı% 90'ın olduğundan emin olun. İyice HEK293S GnTI tripsinize süspanse edin – DMEM hücre tek kullanımlık bir pipet rezervuar içinde 0.5 x 10 6 hücre / mL yoğunluğunda% 10 FBS ile takviye edilmiştir. Yaklaşık 5.000.000 HEK293S hücreler her bir tabak için gerekli olacaktır. 24 yapıları toplam bu pr kullanarak her tabakta transfekte edilebilirotocol. Bir çok kanallı pipet kullanarak, bir PDL kaplı plakanın her oyuğuna 100 ul hücre ilave edin. Her plaka doldurduktan sonra pipet rezervuar içinde süspanse edin hücreleri hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için. % 8 CO2 ile 37 ° C inkübatör hücreleri inkübe edin. 24 saat sonra, hücreler, yaklaşık% 80 konfluent ulaşmalıdır. Transfeksiyondan önce 1 saat ortamı değiştirin. Transfeksiyon için, DNA transfeksiyon reaktifi kompleksleri hazırlamak. Her bir taranabilir Sert TC arka oluşturmak için, serumsuz DMEM 45 uL 450 ng DNA karışımı ve karıştırılır. serumsuz DMEM 45 ul transfeksiyon reaktifi 1.6 uL ilave et ve karıştır. Hemen DNA çözüm seyreltilmiş transfeksiyon reaktif çözümü eklenir ve karıştırılır. ters çözüm karışmaz. 15 dk ve 4 kuyu transfeksiyon reaktif / DNA karışımı 20 mcL – 10 bekleyin. Tüm kuyular transfekte edildikten sonra, yavaşça geri sallanan ile plaka mixnd ileri ve 37 ° C inkübatör dönmek. 24 saat DMEM içeren serum ve 10 mM sodyum bütirat ile medya değiştirin – 16 sonra. Yaklaşık 48 saat sonra transfeksiyon ortamı çıkarın ve ya hemen sonra kullanılmak üzere -80 ° C'de hücreleri ısıya dayanıklıdır ekran ile devam ya da dondurun. Hücreler, bir kaç hafta içinde, -80 ° C'de saklanabilir. S -citalopramın 2. Sintilasyon Yakınlık tabanlı Termostabilite Ekran Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca – (20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl, Tris-tamponlu tuzlu su) TBS 25 uL 200 nM S -citalopramın kuluçkaya bırakılır. ekleyerek, hücreleri eritmek 8 mM N-dodesil-β-D-maltopiranozit (C12M), 1mM kolesteril hemmisuccinate (CHS), proteaz inhibitör kokteyli (2 mM fenilmetansülfonil florit (PMSF), 0.1 mg / mL aprotinin, 4 g 25 uL / ml pepstatin A ve 4 ug / ml löpeptin) TBS içinde, ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe. TBS wi 50 uL ekleyininci 20 nM [3H] sitalopram (81.7 Ci / mmol),% 0.1 sığır serum albümini ve 2 mg / ml His-tag afinite sintilasyon yakınlık deneyi (SPA), her yapı için üç kuyu için boncuklar. son için iyi listelenen aynı çözüm eklemek, ancak spesifik olmayan bağlanmasını belirlemek için 100 mcM sertralinle tamamlar. 96-iyi levhaya eklerken His-tag afinite SPA taneleri iyice karışmasını sağlamak. Ölçüm [3H] sitalopram oyuk başına 1 dakika sayımı kez oda sıcaklığında 96 oyuklu bir sintilasyon sayacı kullanılarak bağlanması. toplam sayım (yaklaşık 36 saat sonra) plato kadar sayma plakaları devam edin. 33 ° C 'de ısıtılmış kapak ile, bir ısıtma bloğu içinde 15 dakika için ısı plakalar. 2.4'te tarif edildiği gibi [3H] sitalopram ısıtıldıktan sonra yeniden birleşimini ölçebilir. Adımı tekrar 2,4-2,5 ve 36 ° C, 39 ° C, 45 ° C, 48 ° C, 51 ° C'ye kadar ısıtma aşamasını değiştirin. Belirgin erime sıcaklığına bağlı olarak ısıtma sıcaklıkları ayarlayın (Tm)Hedef protein ve en kararlı yapının termostabilite. Tüm yapılar düşük özgül sayıları elde edene kadar plakaları ısıtmak için devam edin. Tm değerlerini belirlemek için verileri analiz edin. 3 tekrarlı kuyu ortalamasını alarak sertralin içermeyen kuyuları için inşa her ortalama toplam sayıları min başına (CPM) belirleyin. Tek bir plaka içeren her sertralin CPM ortalaması alınarak spesifik olmayan CPM belirler. toplam CPM gelen spesifik olmayan CPM çıkarılarak özel CPM hesaplayın. Boltzmann sigmoid fonksiyonu doğrusal olmayan bir geçme ile Tm hesaplanır. Oda sıcaklığında düşük özgül CPM (<WT% 10) ile Yapıları genellikle doğru Tm değerleri yoktur. En termo yapılardan mutasyonlar bir araya getirildi ve termostabilite katkı artar taranabilir. HEK293S GnTI İnsan serotonin taşıyıcı 3. Ekspresyon <sup> – Hücreler plazmid 1 ng kimyasal yetkin DH10Bac hücrelerini dönüştürmek. DH10Bac hücreleri 50 ul plazmid ilave edin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. 30 saniye için 42 ° C sıcaklıkta ısı şoku DH10Bac hücreleri. SOC ortamı, 200 ul ekleyin ve çalkalanarak 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Levha 50 ug / ml kanamisin, 7 ug / ml gentamisin, 10 ng / ml tetrasiklin, 100 ug / ml 5-bromo-3-indolil β-D-galaktopiranosid ihtiva eden Luria Broth (LB) plakası üzerine bakterilerin tümünü ve 40 ug / ml izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG). LacZ izole – LB agar plakaları üzerinde 2 gün boyunca 37 ° C'de büyütüldü koloniler (beyaz koloni). LB ihtiva eden antibiyotik 5 mL, 37 ° C 'de pek çok koloniler O / N büyütün ve Bacmid DNA, izole eder. 5 dakika boyunca santrifüj içinde 1000 x g'de bakteri dönerler. Süpernatantı atın. miniprep r 200 uL ile yeniden süspanse bakteriesuspension tamponu. miniprep lizis tamponu 200 mcL ekleyerek ve yavaşça 10 kez tersini tüp lyse bakteri. nötralizasyon tamponu 200 mcL ekleyin. bir santrifüj içinde 10 dakika için 14,000 x g'de iplik çözünür olmayan kısmın çıkarılması. 20 dakika DNA çökeltilmesi için -20 ° C'de süpernatana izopropanol ve soğuk 1 ml ekleyin. bir santrifüj içinde 15 dakika için 14,000 x g'de spin ve süpernatant atılır. Yıkama DNA,% 70 EtOH ile pelet haline getirilmiş ve 15 dakika için 14,000 x g'de tekrar döndürün. Süpernatantı atın. Tüm EtOH kadar Hava kuru DNA buharlaştırılır ve su 50 uL tekrar süspansiyon vardır. Not: Bacmid DNA, hemen en iyi sonuçlar için Sf9 hücreleri içine transfekte olması gerekir, ancak, aynı zamanda birkaç hafta -20 ° C'de saklanabilir. Transfect 6 oyuklu tabakta 27 ° C'de nemlendirilmiş bir haznede lekelenmiştir yetiştirilen yapışık Sf9 1×10 6 hücrelerine bakmid DNA'sını. steril bir laminer akış başlığı içinde, tüm hücre kültüründe kullanılan gerçekleştirin. <li> hücrelerden ortamı çıkarın ve taze Sf9 medya 2 mL ekleyin. Sf9 ortam, 100 uL (Çözelti A) Bacmid DNA, 5 ug ekleyin. Sf9 ortam, 100 uL (solüsyon B) bir katyonik lipid Sf9 transfeksiyon reaktifi 8 uL ekleyin. 5 dakika boyunca çözeltiden B içeren tüp inkübe edin. Çözelti B tüp ihtiva eden çözelti, karıştırın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe ve Sf9 hücreleri çözüm tüm ekleyin. 0.2 um'lik bir filtreden geçirilerek 96 saat, hasat süpernatan (P1 virüsü) sonra. P1 virüsü karanlıkta 4 ° C'de birkaç ay boyunca saklanabilir ve gerektiğinde P2 virüsü hale getirmek için tekrar kullanılabilir. Sf9 ortam içinde 1 x 10 6 hücre / mL yoğunluğunda Sf9 hücrelerinin 1 L 100 uL P1 virüsü ekleyin. 100 rpm'de bir çalkalama 27 ° C 'de büyümekte, 96 saat hücreleri enfekte etmektedir. 15 dakika ve 0.2 um'lik bir filtreden virüs partikülleri içeren süpernatan filtre 4,000 xg'de santrifüj hücreleri dönerler. Hücre pelet atın. unsurlarviral plak deneyi veya bir virüs sayacı kullanılarak ine viral yoğunluk. Virüs yoğunluğu mililitre başına> 1 x 10 8 virüs parçacıkları olmalıdır. P2 virüsü karanlıkta 4 ° C'de saklandı ve birkaç ay boyunca kullanılabilmektedir. HEK293S GnTI 10 L Infect – süspansiyon içinde büyüyen hücrelerin 7, 37 ° C 'de% 8 CO2 ve% 85 nem ile bir çalkalama düzenine% 2 FBS ile takviye edilmiş 293 sentezleme ortamı 130 rpm bir enfeksiyon çokluğu 2 (MOI) ve / ml, tipik olarak 30, 3 x 10 6 hücre yoğunluğu – 50 ml 2 L hücre 800 ml başına P2 virüsünün şişesindeki. NOT: HEK293S GnTI beri P2 virüsünün 80'den fazla mL kullanılması tavsiye edilmez – Vadesi pH bir değişiklik hücrelerin yavaş yavaş büyüyecek ve unviable hale gelebilir. Sf9 medya 293 ifadesi medyaya daha asidik olduğunu. 12 – Enfeksiyondan 16 saat, 1 M stoktan 10 mM'lik bir konsantrasyonda sodyum bütirat ilave edin. 48-60 saat sonra enfeksiyon, santrifüj ile hasat hücreler15 dakika boyunca 4,000 x g. süpernatantı. TBS 150 mL yeniden süspanse hücreleri, 2 mcM S -citalopram veya diğer SERT inhibitörleri ve -80 ° C'de mağaza saflaştırılması için hazır olana kadar. Bağışıklama ve Kristalizasyon için Serotonin Transporter 4. Affinity Arıtma Hızla homojen olana kadar, 10 ml bir pipet geçirilerek ılık su (yaklaşık 30 ° C) ve tekrar süspansiyon kültür 10 L hücreleri çözülme. 80 mM Tris, pH 8, 40 mM C12M, 5 mM CHS ihtiva eden 150 mM NaCI ve proteaz inhibitörü kokteyli: çözündürme (150 mL) deterjan çözeltisi hazırlayın. Bir karıştırma çubuğu olan bir behere tüm hücreleri ekleyin ve karıştırılırken hücrelere bir deterjan her ekleyin. karıştırılarak 1 saat boyunca 4 ° C'de çözünür. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 8000 x g'de lizat dönerler. temiz ultrasantrifüjdeki tüpler içine pelet ve decant süpernatant atın. Bir ultracent 1 saat boyunca 100,000 x g hızında Spinrifuge. 0.2 mikron filtre ile pelet ve filtre süpernatant atın. Yıkama tampon maddesi içinde dengelenmiş bir peristaltik pompa kullanılarak bir sütun içine yerleştirilmiş 10 ml Strep afinite reçinesi üzerinde lizat geçirin: 1mM C12M, 0.2 mM CHS,% 5 gliserol, 25 uM lipit (1-palmitoil-2-oleoil sn -glycero- 1 bir mol oranında 3-fosfokolin, 1-palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3-fosfoetanolamin, 1-palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3-fosfogliserol: 1: 1) ve 1 um S -citalopram veya TBS içinde SSRI. Bir Hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) sisteme Strep afinite sütunu bağlayın ve yıkama tamponu 66 mL (6.6 kolon hacminde) ile 2 mL / dakika sütun yıkayın. Aynı tampon içinde Elute saflaştırılmış protein tamponu 33 mL (3.3 kolon hacmi) kullanılarak 0.5 ml / dk'da destiobiyotin 5 mM ile takviye edilmiştir. 1 ml'lik fraksiyonlar toplamak; pik fraksiyonlar ~ 10 mi olur. İstendiği takdirde, 3 D – Arıtılmış protein 2, 4 ° C'de depolanabilir. NOT: Toplam verim 3 olacak -SERT CC 4 mg ve SERT IC 1 mg. 280 nm 'de 2 AU absorbans 1 mg / ml SERT eşittir. Bağışıklama lipozomlar içine Taşıyıcının 5. Sulandırma Kolesterol: asolectin içeren lipozomları hazırlamak lipit A: beyin kutuplu lipit (mol oranı 60: 17: 3: 20). 1 mL kloroforma lipitleri çözülür ve belirtilmedikçe molar oranı 100 mililitrelik bir cam yuvarlak tabanlı bir şişeye, toplam lipidin 40 mg ekleyin. yuvarlak tabanlı bir şişe, yaklaşık sıcak su içinde 30 ° C dönen vakum altında en az 1 saat boyunca, kloroform buharlaştırın. TBS 10 ml ekleyerek lipidlerin rehidrate. 10 dakika süre ile tampon maddesi içinde inkübe edilir. Sıvı N 2 balon yerleştirerek lipid dondurun. Çözülme. Ilık su ile dolu bir beher içinde, yaklaşık olarak 30 ° C bir şişe küresel alt bırakın. 5 dakika bir banyo sonikatörü içinde sonikasyon. Vortex ve tekrar adımları 5.1.3 – 5.1.4 10 kez ya da lipid kadartam altından yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve bulutsu bir süspansiyon oluşturur. 200 nm filtreler aracılığıyla iki kez, tüm lipit karışımı a'ya. Lipid ekstrüzyon öncesinde bir sütlü süspansiyon olarak görünecektir; sonra o saydam olacak. o tıkanabilir olarak numunenin kaybı ile sonuçlanan, bir defada ekstrudere tüm lipit karışımı ilave etmeyin. 40 mg / mL'lik bir konsantrasyonda TBS 1 mL – 0.5 20 dakika ve tekrar süspansiyon 100,000 xg'de lipitler dönerler. 2 100 kDa'lık bir MWCO santrifüj proteini konsantratör kullanılarak 500 uL – – 250 saflaştınlmış SERT IC Konsantre 4 mg / ml ve 5 mM C12M lipozomlar doyurulması. deterjan saflaştırılmış SERT ekleyin: lipid karışımı 1 ml nihai hacim içinde. 80 mg / ml, hidrofobik emici reçinenin 3 ilâvesi ile C12M çıkarın. İlk 2 eklemeler için, 4 ° C'de 2 saat boyunca rotasyon ile reçine ile inkübe edin. cam yünü içinden geçirilerek reçine çıkarmak. reçine ile son bir inkübasyon gerçekleştirmebir gecede. 20 dakika boyunca 100,000 x g'de santrifüj ile proteoliposomes konsantre edilir. TBS 500 ul – 250 supernatant ve tekrar süspansiyon pelet atın. Reçinenin son çıkarılmasını takiben yeniden protein S -citalopramın 10 uM nihai konsantrasyon ekleyin. SDS-PAGE yükleme tamponu (62.5 mM Tris, pH 6.8,% 10 gliserol,% 2 SDS,% 0.01 bromofenol mavisi, 100 mM DTT) içinde proteoliposomes 2.5 uL çözündürülmesi ve 1 200 V bir SDS-PAGE jel üzerinde bu SERT sağlamak H başarılı yeniden edilmiştir. Proteoliposomes uzun süreli depolama için parçalar halinde -80 ° C'de saklandı ve her aşılama önce buz üzerinde çözülmüş olabilir. 3D antikorları tanıyanlardır 6. Eleme Western blot ile ekran hibridom hücre çizgileri. Western blot ile SERT tanıyan antikorlar, muhtemelen lineer epitopları bağlayan ve büyük olasılıkla, yapısal çalışmalar için yararlı olmayacaktır. purifi 1 mikrogram karıştırınEd SERT IC veya SERT CC ve 4 üzerinde çalışan – 1 saat boyunca 200 V'ta% 15 SDS-PAGE jeli. Towbin tamponu kullanılarak 30 dakika boyunca (25 mM Tris, 192 mM glisin,% 20 (h / h) metanol,% 0.1 SDS), 200 mA bir nitroselüloz zara transfer edin. Membran, kurutuldu ve oda sıcaklığında süresiz olarak saklanabilir. Yeniden ıslanma,% 10 metanol ile membran ve PBS ile yıkayın (10 mM fosfat, pH 7.4, 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI). Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS içinde% 5 süt tozu ile bloke edin. PBS ile yıkayın% 0.1 süt ile PBS içinde antikorun 1 ug / ml ile inkübe edin. PBS,% 0.1 Tween-20 ihtiva eden iyice yıkayın. % 0.1 Tween 20 ve% 0.1 süt ile PBS içinde 10.000: IR boyası konjuge keçi anti-fare antikoru ile inkübe 1 seyreltilmiştir. yoğun yıkayın ve bir görüntüleme sistemi kullanılarak tarayın. (2 SER: 1 molar oranı ile, 100 nM SERT CC proteini ile Western Negatif antikorları içeren hibridoma süpernatant karıştırınT: 1mM C12M, 0.2 mM CHS ve 1 uM S -citalopramın 200 uL TBS içinde mAb). 20 dakika boyunca 100,000 x g'de santrifüjleyin. SERT-mAb kompleksleri içeren süpernatant analiz ve Floresan algılama Boyut Dışlama Kromatografisi (FSEC) 8 ile analiz edin. pelet atın. TBS, 0.4 mM içeren çalışan bir tampon (510 nm: 480 nm, emisyon uyanm) floresan detektörü ile donatılmış bir yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) kullanılarak 0.5 ml / dk'da bir ebat eksklüzyon kolonu üzerinde yüzer, 100 uL başlat lauril maltoz neopentil glikol ve 1 uM S -citalopram. kompleksler oluşturan antikorlar, GFP füzyon proteini boyut dışlama kolonundan serbest taşıyıcı daha önce elüte neden olur. 1 mM C12M 200 uL TBS içinde 10, 1, 0.1 nM, 0.2 mM CHS ve 1 uM S -citalopramın ve tekrar işleme FSEC için kompleksleri seyreltilir. hala düşük nanomolar konsantrasyonlarda taşıyıcı tepe kayabilir antikorlardıryüksek afiniteli bağlayıcılar ve yapısal çalışmalar için iyi bir aday. 1 mM serotonin mevcudiyetinde FSEC ciltlenmesini yeniden test edin. özellikle SSRI bağlanmış yapıyı tanıyan antikorlar, alt-tabakanın mevcudiyetinde bağlamayacaktır. konformasyon sonucu değişmez 3B epitopu tanıyan antikorlar, ne olursa olsun, bağ mevcut bağlanacaktır. Antikorların ikili farklı kombinasyonları karıştırın ve FSEC ile bağlanma açısından test edin. apayn epitopları tanımaktadır antikorlar, tek bir antikor bağlanması ile karşılaştırıldığında birbirine birleştirildiğinde SERT önce elüte neden olur. İlk yapı çalışmaları için de, 3D epitopları tanıyan yüksek afinite antikorları seçmek. Sf9 hücrelerinde antikor parçasının 7. Ekspresyon standart protokoller kullanılarak Sf9 hücrelerinde ekspresyon için böcek ekspresyon sistemi içine PCR tarafından Fab klon değişken ve sabit alan. Transfect 1 x 1(Bölüm 3.4 başı gibi) GP67 salgı dizisi 8-His takılı 8B6 Fab, hafif ve ağır zincirleri kodlayan Bacmid DNA, 5 ug 0 6 Sf9 hücreleri. Hasat P1 virüsü 96 saat transfeksiyondan P2 virüsü yapmak için bir 2 L'lik bir şişede, 1 x 10 6 hücre / mL yoğunluğunda Sf9 hücreleri 1 L P1 virüsünün 500 ul ilave edin. 27 ° C 'de 96 saat hücreleri enfekte etmektedir. Hasat P2 virüsü (bölüm 3.6 göre). Her 2 L bir şişe içinde Sf9 hücrelerinin 1 L bir şişeye 50 mL – P2 virüsü, tipik olarak 40 ile 2 MOI 3 x 10 6 hücre / mL – 2 yoğunluğunda Sf9 hücreleri 6 L Infect. Hasat hücreler yaklaşık 96 saat İnokulasyonu. 20 dakika boyunca 4000 x g'de hücreleri ve spin 50 mM nihai konsantrasyona fosfat tampon maddesi, pH 8 50 mL. 0.2 um'lik bir filtreden teğetsel akış hücresi içinden hücre pelletini ve filtre Süpernatant atılır. İstendiği takdirde, 3 gün – 2, 4 ° C'de süpernatan ve depolayan. <p class="jove_title"> 8. Sf9 süpernatanından Antikor Parçalarının Saflaştırılması 800 ml – yaklaşık 400, 30 kDa'lık bir moleküler ağırlık Kesilmiş (MWCO) teğetsel akış hücresi kullanılarak Sf9 süpernatant konsantre edilir. 10 mM ve His-etiketi afinite reçinesi, 10 mL bir son konsantrasyonda imidazol, pH 8 ekleyin. 4 ° C'de 1 saat süreyle bir beher içinde karıştırılır. 5 dakika boyunca 2,000 x g'de santrifüj ile His-tag afinite reçinesi toplayın. Süpernatantı atın. Bir sütuna His-tag afinite reçine paketi ve bir FPLC bağlanın. 50 mM fosfat, pH 8, 150 mM NaCI, 25 mM imidazol 66 mL (6.6 kolon hacminde) ile 2 mL / dakika ile His-tag afinite reçinesi yıkayın. 50 mM fosfat, pH 8, 150 mM NaCI, 250 mM imidazol 33 mL Elute 8B6 Fab. 1 ml'lik fraksiyonlar toplanır. buz soğukluğunda 20 mM asetat, pH 5 10 kat hacim Fab saflaştınldı afiniteye seyreltilir. 1 mL / dakika bir peristaltik pompa kullanılarak 1 ml katyon değiştirme kolonuna Fab bağlayın. 30 ml lin kullanarak ayrı Fabbir FPLC kullanılarak 20 mM asetat pH 5.5 içinde – (500mM 0) NaCI kulak gradyanı. FAB-MS, 300 mM NaCl'de, tek bir tepe noktası olarak elüte olur. 100 mM DTT ihtiva eden bir örnek tamponu kullanılarak bir% 12.5 SDS-PAGE jeli üzerinde analiz edin. 8B6 Fab ağır ve hafif zincirlerinin bir indirgeyici SDS-PAGE jeli üzerinde sırasıyla, 27 ve 25 kDa çalışacaktır. 3.000 x g'de bir sallanan kepçeli santrifüjde 30 kDa'lık bir MWCO proteini konsantratör kullanılarak 15 mg / mL – Fab içeren havuz kısımlar ve en az 10 kadar konsantre edilir. 4 ° C'de uzun bir dönem için Fab saflaştırılarak son 50 mM konsantrasyonda ve saklamak için 1 M Tris pH 8 eklenerek pH 8'e ayarlayın. 30 mg – Toplam verim 25 olacak. 280 nm 'de 1.4 AU absorbans 1 mg / 8B6 Fab mL eşittir. Boyut Dışlama Kromatografisi ile Transporter-antikor Kompleksleri ve Ayırım 9. oluşumu Daha önce (bölüm 4) tarif edildiği gibi kristalleştirme için, C12M LTR yükseltici afinite kromatografisi ile SERT CC saflaştırılması. <li> Trombin ile Özet etiketleri çıkarmak için (1: ağırlık / ağırlık, 100) ve EndoH O (1:10 a / a) / RT N. 10 mg / ml bir protein konsantrasyonuna 100 kDa'lık bir MWCO santrifüj proteini konsantratör kullanılarak 300 uL – 250 için konsantre edilir. 1 bir mol oranında Fab ile konsantre SERT karıştırın: 1.2 500 uL daha az bir hacim içinde. 20 dakika boyunca 4 ° C'de 100,000 x g'de santrifüjleyin. SERT-Fab kompleksi içeren süpernatant toplayın. Sil pelet. TBS içinde dengelenmiş bir ebat eksklüzyon kolonu üzerinde FPLC ile Boyut Dışlama Kromatografisi (SEC) ile ayrı n-oktil-β-D-maltozit 40 mM (C8M), 0.5 mM CHS,% 5 gliserol, 25 uM lipit (Aynı durum ile desteklenmiş aşama 4.5) ve 0.5 mL / dakika, 1 uM G -citalopramın bölgesindeki. 0.5 mL kesirler toplamak ve 4 analiz -% 15 SDS-PAGE jelleri yanı sıra SEC tarafından triptofan floresan. GFP SERT, bir SDS-PAGE jeli üzerinde de yaklaşık 80 kDa çalışır etiketli. termini çıkarılması ve N-bağlantılı şekerlerin sonra bir 45 kDa proteini olarak çalışır. detefraksiyonlar triptofan floresans SEC tarafından fraksiyonlarının analizi ile belirlendiği üzere tek dağılımlı sadece kısımların havuzlanmasıyla birleştirmek rmine (eksitasyon: 280; emisyon: 335 nm). Mağaza 1 hafta kadar 4 ° C 'de SERT-8B6 kompleksi saflaştırılmıştır. Drop Asma tarafından Transporter-antikor komplekslerinin 10. Kristalizasyon kristalleştirme öncesinde, 100 kDa'lık bir MWCO santrifüj proteini konsantratör kullanılarak 2 mg / mL Sert-8B6 kompleksinin SEC ayrılması elde edilen pik fraksiyonların konsantre. 280 nm 'de 2 AU absorbans 1 mg / mL kadardır. 1 oranında ek Fab ekleyin: 0,05 kompleksi: ücretsiz Fab. 10 mcM ücretsiz S -citalopram ekleyin. 20 dakika boyunca 4 ° C'de 100,000 x g'de santrifüjleyin. SERT-Fab kompleksi içeren süpernatant toplayın. Sil pelet. Tablo 1 'e göre olan 4 ° C' de asılı damla 24 oyuklu ekranı ayarlayın. Rezervuar çözümler üzerinde kırılma kalitesi kristallerinin oluşması125 mM KCI, 32.5 – -% 34 PEG 400 ve% 0.5 6-aminoheksanoik asit, 100 mM Tris-NaOH, pH 8.5, 25 ihtiva etmektedir. Not: bir tampon, pH 8.5'e NaOH ile ayarlandı kullanımlar Tris. HCl ile ayarlanmış Tris baz kullanmayın. Ekran 2 ml tüpler hazırlanan ve bitene kadar kullanılabilir. doğru son derece viskoz olduğu gibi pozitif deplasmanlı pipet kullanarak PEG 400 pipetle için dikkat! her bir tatbik sızdırmazlık maddesi ile düşük profilli 24 kuyulu bir levhadaki her rezervuar çözeltisi pipetle 500 uL. Pipet 1.5, 1.75 ve 18 mm'lik silikonlu cam kapak slip üzerine SERT-8B6 kompleksinin 2 uL. Protein numunesi üzerine rezervuar çözeltisi pipetle 1 pL. NOT: levha zaten kuyu kenarına uygulanan dolgu ile satın alındı. rezervuar çözümü bakacak damla 24-kuyuya kapak slayt uygulayın ve dolgunun her kuyuya önceden uygulanan üzerine kapak kayma basarak hemen kapatın. 24-kuyu kurulmuştur kadar devam edin. </li> 4 ° C 'de, iyi izole edilmiş bir odada mamul levha bırakın. En az 3 gün boyunca plakaları rahatsız etmeyin NOT: Tek kristaller yaklaşık 3 gün içinde ortaya çıkar ve 14 gün sonra 100-175 um büyüyecektir. Hasat cryoloops kristaller ve önceki X-ışını difraksiyon verileri toplama sıvı N 2 ile doğrudan flaş-soğutun. Gerekirse, asılı damla geniş tarama ek kristalleşme koşullarını bulabilirsiniz. 2 Yağışlı oranları: 1, 1.5: 1, 1: protein ile üç damla kullanın 1. Robot mevcut ise, o zaman 100-150 nL, 96 oyuklu bir plaka içerisinde rezervuar çözeltisi üzerinde 70 ul damla ayarlayın. Büyük 3D kristaller 24 kuyularda yetiştirilebilir. damla görünümünü dayalı Puan: 0, berrak; 1, toz; 2, taneli çökelti; 3 faz ayrılması; 4, mikrokristalin; 5, iğneler; 6, tabaklar; 7, 3D kristaller. yeni tanımlanan koşul etrafında yukarıda açıklandığı gibi 24 kuyularda damla yöntemleri asarak kristalleşmesini kurmakitions.